यहाँ हम एक नैदानिक प्रासंगिक, उच्च दक्षता, फीडर मुक्त विधि का वर्णन करने के लिए प्रेरित pluripotent स्टेम कोशिकाओं में मानव प्राथमिक fibroblasts reprograming संशोधित mRNAs एंकोडिंग reprogram कारकों और परिपक्व microRNA-367/ भी शामिल reprogramminging दक्षता का आकलन करने के लिए तरीके हैं, क्लोनल iPSC कालोनियों का विस्तार, और pluripotency मार्कर तर्-1-60 की अभिव्यक्ति की पुष्टि करें ।
प्रेरित pluripotent स्टेम सेल (iPSCs) मानव विकास और रोग का अध्ययन करने के लिए एक महत्वपूर्ण उपकरण साबित हो गया है । इसके अलावा आगे बढ़ने के रूप में iPSCs एक अपक्षयी चिकित्सकीय एक सुरक्षित, मजबूत, और समीचीन regenerativeing प्रोटोकॉल की आवश्यकता है । यहां, हम एक गैर-एकीकृत दृष्टिकोण का उपयोग iPSCs में मानव चमड़े का fibroblasts के अत्यंत उच्च दक्षता reprogramminging के लिए एक नैदानिक प्रासंगिक, कदम दर कदम प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं । प्रोटोकॉल के कोर pluripotency कारकों व्यक्त करने के होते है (SOX2, KLF4, cMYC, LIN28A, NANOG, OCT4-MyoD संलयन) इन विट्रो से संशोधित RNAs के साथ संश्लेषित दूत न्यूक्लियोटाइड (संशोधित mRNAs) । reprogramminging संशोधित mRNAs प्राथमिक fibroblasts में transfected है हर ४८ घंटे के साथ एक साथ परिपक्व भ्रूण स्टेम सेल-विशिष्ट microRNA-367/ परिणामी iPSC कालोनियों को फिर पृथक किया जा सकता है और सीधे फीडर मुक्त स्थितियों में विस्तारित । दक्षता और fibroblast नमूनों भर में हमारे reprogramminging प्रोटोकॉल की निरंतरता को अधिकतम करने के लिए, हम आरएनए अभिकर्मक आहार, transfections के समय, संस्कृति की स्थिति, और सीडिंग घनत्व सहित विभिन्न मापदंडों को अनुकूलित किया है । महत्वपूर्ण बात, हमारे विधि सबसे fibroblast स्रोतों से उच्च गुणवत्ता वाले iPSCs उत्पंन करता है, जिसमें मुश्किल से पुनः कार्यक्रम रोगग्रस्त, वृद्ध, और/
प्रेरित pluripotent स्टेम सेल (iPSCs) में दैहिक कोशिकाओं reprogramminging प्रतिलेखन कारकों का एक कोर सेट है कि pluripotency1,2को बनाए रखने में महत्वपूर्ण है की विस्तारित अभिव्यक्ति की आवश्यकता है । नैदानिक अनुप्रयोगों के लिए iPSCs का निर्माण करते समय, यह आवश्यक है कि इनपुट कोशिकाओं में उत्परिवर्तन का बोझ प्रसंस्करण के दौरान छोटा किया जाता है और iPSC पीढ़ी की कुशलता रोगी नमूनों में अपेक्षाकृत उच्च स्तर पर बनाए रखी जाती है । हालांकि, एकीकरण-मुक्त प्रोटोकॉल सहित reprogramminging तरीकों के बहुमत, बहुत कम reprogramminging क्षमता है, जो इन3दृष्टिकोण के नैदानिक उपयोगिता की सीमा से ग्रस्त है । कम reprogramminging दक्षता भी मौजूदा उत्परिवर्तनों ले जाने कोशिकाओं के चयनात्मक reprogramminging को बढ़ावा देने, परिणामस्वरूप iPSCs में उत्परिवर्तन बोझ बढ़ सकता है । इसके अलावा, सभी डीएनए आधारित reprogramminging तरीकों, जैसे lentivirus-और episomal आधारित दृष्टिकोण, सुरक्षा चिंता है कि डीएनए बेतरतीब ढंग से जीनोम में एकीकृत कर सकते है और हानिकारक संमिलनत्मक mutagenesis और अवांछित के लिए अवसर बनाने से पीड़ित ( संभावित oncogenic) बहाव ऊतक डेरिवेटिव में pluripotency जीन की अभिव्यक्ति4.
एक होनहार दृष्टिकोण दैहिक कोशिकाओं में pluripotency के कुशल प्रेरण प्राप्त करने और परिणामी iPSCs में उत्परिवर्तन बोझ को कम करने के लिए सिंथेटिक छाया दूत RNAs युक्त संशोधित nucleobases (संशोधित mRNAs)5reprogramminging के लिए उपयोग है । संशोधित mRNA आधारित reprogramminging दृष्टिकोण की दक्षता आगे भ्रूण स्टेम सेल जोड़कर बढ़ाया जा सकता है (ESC)-विशिष्ट microRNAs (miRNAs)-367/302s3, जो वृद्धि की क्षमता 6 के साथ दैहिक कोशिकाओं reprogramming करने के लिए दिखाया गया है ,7. हालांकि, यहां तक कि miRNAs-367/302s के अलावा, संशोधित mRNA-आधारित reprogramminging approach अक्सर अनुप्रयोग के दौरान हौसले से अलग रोगी कक्ष3के लिए विफल रहता है । इस संशोधित mRNA-आधारित दृष्टिकोण की विसंगतियों को संबोधित करने के लिए, हम हाल ही में एक अनुकूलित, एकता मुक्त रणनीति है कि एक उच्च सफलता दर और इस्तेमाल दोनों संशोधित mRNAs एंकोडिंग के साथ मानव प्राथमिक fibroblasts में pluripotency लाती है की सूचना दी है reprogramminging कारकों और परिपक्व miRNA-367/ हमारे विधि में, reprogramminging संशोधित mRNA कॉकटेल OCT4 का एक संशोधित संस्करण शामिल MyoD transactivation डोमेन (एम3ओ कहा जाता है)9 और पांच अंय reprogramminging कारकों (SOX2, KLF4, cMYC, LIN28A, और NANOG) के साथ जुड़े । संशोधित mRNA के साथ pluripotency कारकों एंकोडिंग miRNA नकल के संयोजन इस प्रोटोकॉल में reprogramminging क्षमता पर एक synergistic प्रभाव है दिखाई दिया । आरएनए अभिकर्मक आहार के अतिरिक्त अनुकूलन, सेल सीडिंग, और संवर्धन की स्थिति भी एक अल्ट्रा उच्च स्तर8के लिए दृष्टिकोण की reprogramminging दक्षता बढ़ाने के लिए आवश्यक थे ।
कई अंय प्रोटोकॉल के विपरीत, हमारे reprogramminging दृष्टिकोण आमतौर पर केवल कुछ हजार इनपुट fibroblasts की आवश्यकता है । इसके अलावा, कई आम गैर एकीकृत episomal plasmids, सेंडाइ वायरस, या आत्म-नकल आरएनए का उपयोग रणनीति व्यापक passaging उत्पंन iPSCs में reprogramminging वेक्टर पतला शामिल है । इसके विपरीत, संशोधित mRNA और परिपक्व miRNA नकल एक छोटी आधा जीवन है और तेजी से कोशिकाओं से सफाया कर रहे हैं । एक साथ ले लिया, रोगी के नमूनों को इकट्ठा करने और प्रयोग करने योग्य iPSCs की पीढ़ी के बीच संचई सेल संस्कृति समय की राशि इस दृष्टिकोण में कम है, प्रभावी रूप से परिणामी iPSCs में उत्परिवर्तन संचय सीमित है और लागत प्रभावशीलता में सुधार ।
यहां, हम विस्तृत कदम दर कदम प्रोटोकॉल को प्राप्त करने के लिए उच्च-दक्षता reprogramminging वयस्क मानव fibroblasts के iPSCs में हमारे मिश्रित संशोधित mRNA/miRNA-आधारित8दृष्टिकोण का उपयोग कर । इस आरएनए-आधारित reprogramminging प्रोटोकॉल एक सरल, लागत प्रभावी, और मजबूत सृजन के लिए विधि प्रदान करता है-अनुसंधान और संभावित नैदानिक अनुप्रयोगों के लिए मुक्त iPSCs । इसके अलावा, यह मुश्किल-reprogramming, रोग से जुड़े, वृद्ध, और वृद्ध होनेवाला fibroblasts सहित fibroblast लाइनों की एक किस्म के reprogramminging के लिए लागू है । मानव fibroblasts reprogramminging के लिए प्रोटोकॉल की एक योजनाबद्ध चित्र 1में दिखाया गया है । प्रोटोकॉल विशेष रूप से एक 6-अच्छी तरह से प्रारूप प्लेट में मानव वयस्क प्राथमिक fibroblasts के तीन कुओं reprogramminging के लिए एक विधि का वर्णन करता है । दो कुओं आमतौर पर उच्च गुणवत्ता iPSC कालोनियों की पर्याप्त संख्या में उपज । कई मामलों में, केवल एक अच्छी तरह से आवश्यक है, और तीसरी अच्छी तरह से reprogramminging दक्षता के विश्लेषण के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । यदि आवश्यक हो तो कुओं की संख्या को स्केल किया जा सकता है ।
इस प्रोटोकॉल का वर्णन एक नैदानिक-प्रासंगिक, गैर एकीकृत, आरएनए-आधारित विधि है कि एक अल्ट्रा उच्च दक्षता पर iPSCs में सामांय और रोग से जुड़े मानव fibroblast लाइनों के reprogramminging के लिए अनुमति देता है । तारीख करने के लिए, हर मानव fibroblast लाइन हम वर्णित प्रोटोकॉल के साथ reprogram करने का प्रयास किया है बहाव अनुप्रयोगों के लिए उच्च गुणवत्ता iPSCs की एक संतोषजनक संख्या में झुकेंगे । परिणामस्वरूप iPSCs तुरंत स्थानांतरित किया जा सकता है और फीडर मुक्त संस्कृति की स्थिति में विस्तार ।
reprogramminging के लिए fibroblasts की गुणवत्ता:
reprogramminging सफलता भारी fibroblasts शुरू करने की गुणवत्ता पर निर्भर है । आदर्श रूप में, reprogramminging सबसे कम बीतने fibroblasts उपलब्ध उच्चतम दक्षता प्राप्त करने के साथ शुरू किया जाना चाहिए । reprogramminging दक्षता बीतने के fibroblasts के साथ सबसे अच्छा है 2-4 । reprogramminging अभी भी उच्च बीतने के साथ काम कर सकते है (5 गद्यांश-8), यहां तक कि वृद्ध होनेवाला fibroblasts, हालांकि एक कम दक्षता के साथ । कई बार कम बीतने fibroblasts अनुपलब्ध है या रोगी के नमूने एक आनुवंशिक उत्परिवर्तन है कि स्वस्थ विकास को रोकता है । इस मामले में, प्रारंभिक चढ़ाना घनत्व के अनुकूलन की आवश्यकता हो सकती है । समझौता fibroblast लाइनों के reprogramminging आमतौर पर आरएनए transfections के दौरान वृद्धि की कोशिका मृत्यु के साथ जुड़ा हुआ है । नतीजतन, reprogramminging में कोशिकाओं को अच्छी तरह से 10 दिनों से विरल होना दिखाई देगा reprogramminging के 14 । बड़े acellular क्षेत्रों में भी गजब के दृश्य दिखेंगे । यदि यह स्थिति है, reprogramminging प्रोटोकॉल की आवश्यकता होगी fibroblasts की एक उच्च प्रारंभिक प्रारंभ संख्या के साथ पुन: प्रारंभ करने के लिए । चढ़ाना ३,००० इनपुट कोशिकाओं के प्रति अच्छी तरह से एक 6-well प्रारूप पकवान सबसे वयस्क fibroblast लाइनों के लिए लगातार काम करता है । हालांकि, 5000-10000 (वृद्ध होनेवाला लाइनों के लिए ५०,०००) के लिए चढ़ाना संख्या में वृद्धि रोग से जुड़े नमूनों की reprogramminging में सुधार करने में मदद कर सकते हैं, हमारे पिछले8प्रकाशन में सूचित किया गया है के रूप में । इसके विपरीत, भी जल्दी reprogramminging के लिए प्रतिरोधी किया जा सकता है प्रवाह तक पहुंचने कोशिकाओं । यदि कोशिकाओं reprogramminging RNAs पैदा करना के साथ भी तेजी से transfections के दौर से गुजर (के रूप में प्राथमिक नवजात fibroblasts के साथ कभी-कभार मामला है), एक 6 अच्छी तरह से प्रारूप8डिश के प्रति ५०० fibroblasts के साथ reprogramminging शुरू ।
अभिकर्मक बफ़र की हैंडलिंग:
अभिकर्मक बफर के पीएच (कम सीरम ८.२ के पीएच को समायोजित मध्यम) इष्टतम अभिकर्मक इस reprogramminging प्रोटोकॉल के लिए आवश्यक क्षमता को प्राप्त करने के लिए सर्वोपरि है । इस कारण से, अभिकर्मक बफ़र की हैंडलिंग के बारे में कई सावधानियों की सिफारिश की है । हमने पाया है कि अभिकर्मक बफर के वायुमंडलीय हवा के लिए भी कम जोखिम बफर के पीएच को प्रभावित करता है । इसलिए, अभिकर्मक बफर एक पेंच कैप कंटेनर में ंयूनतम हवा अंतरिक्ष के साथ aliquoted होना चाहिए (हम या तो 5 या 15 मिलीलीटर पेंच टोपी शंकु ट्यूबों का उपयोग करें) । आगे हवा जोखिम को कम करने के लिए, दो transfections की एक अधिकतम के लिए प्रत्येक अभिकर्मक बफर aliquot का उपयोग करें । अंत में, के बाद से तापमान प्रभावों पीएच, यह महत्वपूर्ण है कि अभिकर्मक बफर अभिकर्मक परिसरों के विधानसभा के लिए आर टी equilibrated है । यह ३७ ° c करने के लिए अभिकर्मक बफर गर्म नहीं करने की सलाह दी है ।
Passaging of iPSCs:
जबकि कई पहले से प्रकाशित प्रोटोकॉल reprogramminging के अंत में व्यक्तिगत iPSC कालोनियों उठा सिफारिश, यह जब reprogramminging की दक्षता बहुत अधिक है या यदि एक साथ कालोनियों क्लस्टर, के रूप में अक्सर मामला है प्राप्त करने के लिए मुश्किल हो सकता है हमारे प्रोटोकॉल. इसलिए, यदि iPSC कालोनियां एक-दूसरे से निकटता में हैं, तो हम अनुशंसा करते है कि पहले मैंयुअल रूप से चुनने से पहले reprogrammeed iPSCs को फैलाने के लिए कक्षों का पता करें । इस जल्दी बीतने कदम प्रदर्शन करने के लिए कई फायदे हैं । कालोनियों के बाहर फैल उंहें और अधिक विकसित करने के लिए कमरे देता है, से उठा के लिए बहुत बड़ा कालोनियों उपज अंयथा मूल अच्छी तरह से प्राप्त किया जा सकता है । यह बहुत एक उठाया क्लोन से एक iPSC लाइन की स्थापना में सफलता की दर में सुधार । हम यह भी पाते है कि fibroblasts के साथ अतिरिक्त संस्कृति समय, हालांकि एक पतला अनुपात में, उठाया iPSC कालोनियों की औसत गुणवत्ता में सुधार करने के लिए प्रकट होता है । पूरी तरह से reprogrammeed reprogramme कारक है, जो मदद iPSCs स्थापित करने और फीडर मुक्त सेल संस्कृति की स्थिति में सीधे संक्रमण को कम करने के लिए जारी समर्थन प्रदान कर सकते हैं । Fibroblasts अनायास एक चयनात्मक विकास नुकसान iPSCs की तुलना में जब mTeSR1 में संस्कृति है । इसलिए, प्रदूषित fibroblast कोशिका जनसंख्या जल्दी से 3 के भीतर नगण्य मात्रा को पतला है-4 मार्ग ।
ऐसे Y-२७६३२ के रूप में रॉक अवरोधकों अक्सर मानव iPSCs की दिनचर्या संस्कृति के लिए इस्तेमाल कर रहे हैं । हमने पाया है कि अक्सर और/Y-२७६३२ के साथ कुछ iPSC लाइनों की विस्तारित संस्कृति समग्र गुणवत्ता पर बचके प्रभाव हो सकता है । जब एक का झुरमुट passaging विधि का उपयोग कर, जैसे EDTA के साथ, Y-२७६३२ के बंटवारे के बाद iPSC व्यवहार्यता बनाए रखने के लिए आवश्यक नहीं है । हम पूरी तरह से सभी iPSC अलगाव, विस्तार, या नियमित संस्कृति के लिए Y-२७६३२ के साथ पूरक मीडिया को खत्म कर दिया है ।
प्रोटोकॉल सीमाएं:
वर्णित आरएनए-आधारित reprogramminging दृष्टिकोण करने के लिए एक सीमा प्रारंभिक लागत और reprogramminging रिएजेंट की तैयारी के साथ जुड़े जटिलता है । हालांकि प्रारंभिक प्रक्रियाओं mRNA एजेंट उत्पन्न करने के लिए सभी नियमित हैं और पहले से वर्णित किया गया है (पीसीआर, इन विट्रो प्रतिलेखन, DNase उपचार, कैपिंग, dephosphorylation, शुद्धि), संचयी mRNA एजेंट का उत्पादन है एक अपेक्षाकृत लंबी और गैर तुच्छ प्रक्रिया । इस प्रोटोकॉल के लिए अंय प्रमुख चुनौती transfect कोशिकाओं हर ४८ एच की जरूरत है, reprogramminging प्रोटोकॉल के श्रम तीव्रता में वृद्धि । इन विचारों को प्रतिबंधित किया जा सकता है अगर केवल कुछ रोगी नमूनों की reprogramminging वांछित है । हालांकि, अगर प्राथमिक विचार नैदानिक प्रासंगिक iPSCs की पीढ़ी है या बहुत उच्च reprogramminging दक्षता प्राप्त करने, वर्णित आरएनए-आधारित reprogramminging दृष्टिकोण आदर्श है ।
संक्षेप में, वर्णित उच्च क्षमता आरएनए-आधारित reprogramminging विधि दैहिक कोशिका प्रकार के अनुकूलित अभिकर्मक क्षमता पर टिका के रूप में हमारे पिछले प्रकाशन8में वर्णित के रूप में reprogramminged किया जाएगा । आरएनए अभिकर्मक प्रोटोकॉल इस अध्ययन में प्रस्तुत अत्यधिक मानव प्राथमिक fibroblasts के लिए देखते हैं, लेकिन संभावित रूप से विभिन्न दैहिक कोशिकाओं की reprogramminging दक्षता में सुधार करने के लिए अन्य कोशिका प्रकार के अनुरूप किया जा सकता है ।
The authors have nothing to disclose.
हम स्वास्थ्य के राष्ट्रीय संस्थानों से सहायता अनुदान के लिए आभारी है (T32AR007411-33) और कोलोराडो त्वचा रोगों के विश्वविद्यालय के अनुसंधान कोर सेंटर (P30AR057212) । हम Epidermolysis Bullosa (EB) रिसर्च पार्टनरशिप, EB मेडिकल रिसर्च फाउंडेशन, ईलाज EB चैरिटी, अपक्षयी Epidermolysis Bullosa रिसर्च एसोसिएशन (डेबरा) इंटरनेशनल, किंग Baudouin फाउंडेशन के Vlinderkindje फंड, और गेट्स का भी शुक्रिया अदा करते हैं । फ्रंटियर्स फंड.
Plasmid templates for PCR | |||
pcDNA3.3_KLF4 | Addgene | 26815 | |
pcDNA3.3_SOX2 | Addgene | 26817 | |
pcDNA3.3_c-MYC | Addgene | 26818 | |
pcDNA3.3_LIN28A | Addgene | 26819 | |
pCR-Blunt_hM3O | Addgene | 112638 | |
pCR-Blunt_hNANOG | Addgene | 112639 | |
pCR-Blunt_mWasabi | Addgene | 112640 | |
Modified mRNA in vitro transcription and miRNA mimics | |||
Forward Primer | Integrated DNA Technologies | TTGGACCCTCGTACAGAAGC TAATACG |
|
Reverse Primer (Ordered as ultramer, 4nmol scale) | Integrated DNA Technologies | TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT CTTCCTACTCAGGCTTTATTCA AAGACCA |
|
(ARCA Cap) 3´-0-Me-m7G(5')ppp(5')G | New England Biolabs | S1411S | |
Pfu Ultra II Hotstart 2x Master Mix | Agilent | 600850-51 | |
5-Methylcytidine-5'-Triphosphate | Trilink Biotechnologies | N-1014 | |
Antarctic Phosphatase | New England Biolabs | M0289L | |
DNase I | NEB | M0303S | |
MEGAscript T7 Transcription Kit | ThermoFisher Scientific | AM1334 | |
Pseudouridine-5'-Triphosphate | Trilink Biotechnologies | N-1019 | |
Riboguard RNase Inhibitor | Lucigen | RG90910K | |
RNA Clean & Concentrator | ZymoResearch | R1019 | |
Syn-hsa-miR-302a-3p miScript miRNA Mimic | Qiagen | MSY0000684 | |
Syn-hsa-miR-302b-3p miScript miRNA Mimic | Qiagen | MSY0000715 | |
Syn-hsa-miR-302c-3p miScript miRNA Mimic | Qiagen | MSY0000717 | |
Syn-hsa-miR-302d-3p miScript miRNA Mimic | Qiagen | MSY0000718 | |
Syn-hsa-miR-367-3p miScript miRNA Mimic | Qiagen | MSY0000719 | |
Water (Nuclease free, Not DEPC-treated) | Fisher | AM9937 | Use to dilute modified mRNAs and miRNA mimics |
Fibroblast culture and reprogramming | |||
0.1% Gelatin in H2O | stemcell technologies | #07903 | |
Stericup-GV Sterile Vacuum Filtration System | EMD Millipore | SCGVU05RE | Use to sterilize the transfection buffer and 0.5 mM EDTA in DPBS |
2-Mercaptoethanol | ThermoFisher Scientific | 21985023 | |
6-well plates (tissue culture treated) | Corning | 3516 | |
DMEM/F12 | ThermoFisher Scientific | 11320033 | |
Fetal Bovine Serum | Fisher | 26-140-079 | |
FGF Basic | ThermoFisher Scientific | phg0263 | |
GlutaMax Supplement | ThermoFisher Scientific | 35050061 | Glutamine supplement used for the prepration of media |
Heat Inactivated FBS | Gibco Technologies | 10438026 | |
KnockOut Serum Replacement | ThermoFisher Scientific | 10828010 | |
Lipofectamine RNAiMAX Transfection Reagent | ThermoFisher Scientific | 13778500 | The protocol is optimized for the Lipofectamine RNAiMax transfection reagent |
MEM | ThermoFisher Scientific | 11095080 | |
MEM Non-essential amino acids | ThermoFisher Scientific | 11140050 | |
Opti-MEM I Reduced Serum Medium | ThermoFisher Scientific | 31985070 | Reduced-serum medium, use to make the transfection buffer by adjusting the pH to 8.2, 500 mL |
Opti-MEM I Reduced Serum Medium | ThermoFisher Scientific | 31985062 | Reduced-serum medium, use to make the transfection buffer by adjusting the pH to 8.2, 100 mL |
10 M NaOH | Sigma-Aldrich | 72068 | Make a 1 M solution by diluting in nuclease free water and use for pH adjustment |
Water (Nuclease free, Not DEPC-treated) | Fisher | AM9932 | Use to dilute NaOH and wash a pH meter |
Pen/Strep/Fungizone | GE Healthcare | SV30079.01 | |
rhLaminin-521 | ThermoFisher Scientific | A29248 | Supplied at a concentration of 100 µg/mL, use as a matrix for the reprogramming procedure |
Dulbecco's phosphate-buffered saline (DPBS) | Life Technologies | 14190144 | |
Trypsin-EDTA 0.25% Phenol Red | Life Technologies | 2520056 | |
Vaccinia Virus B18R (CF) | ThermoFisher Scientific | 34-8185-86 | |
iPSC culture | |||
Corning Matrigel hESC-Qualified Matrix | Corning | 354277 | Extracellular matrix (ECM) for culturing iPSCs |
EDTA, 0.5 M stock solution | K&D Medical | RGF-3130 | Dilute to 0.5 mM in DPBS, filter sterilize and use for iPSC passaging |
mTeSR1 | StemCell Technologies | 85850 | Pluripotent stem cell (PSC) medium, provides growth advantage to iPSCs over fibroblasts |
Antibodies and Detection | |||
Rabbit anti Mouse (HRP conjugated) | Abcam | ab97046 | |
Tra-1-60 (mouse anti human) | Stemgent | 09-0010 | |
Hydrogen Peroxide (30%) | LabChem | LC154301 | Dilute to 3% with PBS |
Bovine Serum Albumin (BSA) | Fisher | BP9703100 | |
Phosphate-buffered salin (PBS) | Hyclone | SH30258.02 | Supplied as 10x, dilute to 1x |
VECTOR NovaRED Peroxidase Substrate Kit | Vector Laboratories | SK-4800 | |
Special Equipment | |||
Description | Notes | ||
Biological safety cabinet | |||
Regular humidified tissue culture incubator | Calibrate CO2 using digital meter, fyrite, or equivalent. Equilibrate incubator to 5% CO2, 37°C. | ||
Tri-gas humidified tissue culture incubator | Calibrate CO2 using digital meter, fyrite, or equivalent. Equilibrate incubator to 5% CO2, 5% O2, 37°C. Use for the reprogramming procedure. | ||
pH Meter | Must have resolution to two decimal places. Designate to RNA work if possible. | ||
Inverted microscope | Microscope configured to visualize EGFP for monitoring transfection efficiency. |