Her beskriver vi en klinisk relevant, høy effektivitet, mater-fri metode for å omprogrammere menneskelig primære fibroblaster i indusert pluripotent stilk celler med endrede mRNAs koding omprogrammering faktorer og moden microRNA-367/302 etterligner. Også inkludert er metoder for å vurdere omprogrammering effektivitet, utvide klonal iPSC koloniene, og Bekreft uttrykk for pluripotency markøren TRA-1-60.
Indusert pluripotent stamceller (iPSCs) har vist seg for å være et verdifullt verktøy å studere menneskelig utvikling og sykdom. Fremme fremmarsj iPSCs som en regenererende terapeutiske krever en sikker, robust, og nødvendig omprogrammering protokollen. Her presenterer vi en klinisk relevante, trinnvise protokoll for ekstremt høy effektivitet omprogrammering av menneskelig dermal fibroblaster til iPSCs med en ikke integrert tilnærming. Kjernen i protokollen består av å uttrykke pluripotency faktorer (SOX2, KLF4, cMYC, LIN28A, NANOG, OCT4-MyoD fusion) fra i vitro transkribert messenger RNAs syntetiserte med endret nukleotider (modifisert mRNAs). De reprogramming endret mRNAs er transfekterte i primære fibroblaster hver 48t sammen med eldre embryonale stamcelleforskningen-spesifikke microRNA-367/302 imiterer i to uker. De resulterende iPSC koloniene kan så isolert og direkte utvidet i arkmateren uten betingelser. For å maksimere effektivitet og konsistensen av våre reprogramming protokollen over fibroblast prøver, vi har optimalisert ulike parametere inkludert RNA transfection diett, timing av transfections og oppdrettsforholdene seeding tettheter. Viktigere, genererer våre metoden høy kvalitet iPSCs fleste fibroblast kilder, inkludert vanskelig-å-ha syke, alderen eller senescent.
Omprogrammere somatiske celler til indusert pluripotent stamceller (iPSCs) krever utvidet uttrykk for et sett transkripsjonsfaktorer som er viktige i å opprettholde pluripotency1,2. Produksjon iPSCs for klinisk bruk, er det viktig at mutational byrden på innsettingsceller er minimert under behandlingen og effektiviteten av iPSC generasjon er opprettholdt på et relativt høyt nivå over pasientprøvene. Men lider fleste omprogrammering metoder, inkludert integrasjon-fri protokoller, av svært lav omprogrammering effektivitet, som grense klinisk nytten av disse tilnærminger3. Lav reprogramming effektiviteten kan også fremme selektiv omprogrammere celler med eksisterende mutasjoner, øke mutational byrden i resulterende iPSCs. I tillegg lider alle DNA-baserte reprogramming metoder, for eksempel lentivirus og episomal-baserte tilnærminger, sikkerhet bekymring at DNA tilfeldig kan integrere i genomet og opprette muligheten for skadelig insertional mutagenese og uønsket ( potensielt kreftfremkallende) uttrykk for pluripotency gener i nedstrøms vev derivater4.
En lovende tilnærming til å oppnå effektiv induksjon av pluripotency i somatiske celler og redusere mutational byrden i resulterende iPSCs er å bruke syntetisk avkortet messenger RNAs som inneholder modifisert nucleobases (modifisert mRNAs) omprogrammere5. Effektiviteten av endrede mRNA omprogrammering tilnærminger kan styrkes ytterligere ved å legge til embryonale stamcelleforskningen (ESC)-spesifikke microRNAs (miRNAs)-367/302s3, som har vist seg å omprogrammere somatiske celler med økt effektivitet6 ,7. Men selv med tillegg av miRNAs-367/302s mislykkes den endrede mRNA reprogramming tilnærmingen ofte under søknad til fersk isolert pasienten celler3. Til adressen inkonsekvens i denne endrede mRNA tilnærming, har vi nylig rapportert en optimalisert, integrasjon-gratis strategi som induserer pluripotency i menneskelig primære fibroblaster med høy suksessrate og benytter begge endret mRNAs koding omprogrammere faktorer og modne miRNA-367/302 etterligner8. I vår metode inneholder den reprogramming endret mRNA cocktail en modifisert versjon av OCT4 smeltet sammen med MyoD transactivation domene (kalt M3O)9 og fem andre reprogramming faktorer (SOX2, KLF4, cMYC, LIN28A og NANOG). Kombinere den endrede mRNA koding pluripotency faktorene med miRNA syntes imiterer å ha en synergistisk effekt på reprogramming effektivitet i denne protokollen. Ytterligere optimaliseringer av RNA transfection diett, celle såing, og dyrking forholdene var også nødvendig å øke omprogrammering effektiviteten av tilnærming til en svært høy level8.
I motsetning til mange andre protokoller krever vår reprogramming tilnærming vanligvis bare noen få tusen input fibroblaster. I tillegg innebære mange vanlige ikke-integrere strategies bruke episomal plasmider, Sendai virus eller selvreproduserende RNA omfattende passaging å fortynne reprogramming vektoren i genererte iPSCs. Derimot endret mRNA og modne miRNA imiterer har kort halveringstid og eliminert raskt fra celler. Samlet er kumulative celle kultur tiden mellom samle pasientprøvene og generering av brukbare iPSCs minimal i denne tilnærmingen, effektivt begrense mutasjon akkumulering i resulterende iPSCs og forbedre kostnadseffektivitet.
Her presenterer vi detaljerte trinnvise protokollen for å oppnå høy virkningsgrad omprogrammering av voksen menneskelig fibroblaster til iPSCs med våre kombinasjon endret mRNA/miRNA-basert tilnærming8. Denne RNA-baserte reprogramming protokollen gir en enkel, kostnadseffektiv og robust metode for å generere integrasjon-gratis iPSCs for forskning og potensial klinisk bruk. Videre er det gjelder omprogrammering av en rekke fibroblast linjer inkludert vanskelig-å-ha, sykdomsassosierte, alderen og senescent fibroblaster. En skjematisk av protokollen omprogrammere menneskelig fibroblaster er vist i figur 1. Protokollen beskriver spesielt en metode for å omprogrammere tre brønner av menneskelige voksne primære fibroblaster i en 6-og format-plate. To brønner gir vanligvis et tilstrekkelig antall høykvalitets iPSC kolonier. I mange tilfeller eneste er godt nødvendig, og tredje også kan brukes til analyse av omprogrammering effektivitet. Om nødvendig kan antall brønner besteget.
Denne protokollen beskriver en klinisk relevante, ikke integrert, RNA-basert metode som tillater omprogrammering av normal og sykdomsassosierte menneskelige fibroblast linjer i iPSCs på en ultra-høy effektivitet. Hittil har hver menneskelig fibroblast linje vi har forsøkt å omprogrammere med beskrevet protokollen gitt et tilfredsstillende antall høykvalitets iPSCs for nedstrøms programmer. Resulterende iPSCs kan umiddelbart overført og utvidet i mater-fri kultur forhold.
Kvaliteten på fibroblaster omprogrammere:
Omprogrammere suksess er sterkt avhengig av kvaliteten på starter fibroblaster. Ideelt sett bør omprogrammering startes med de laveste passasje fibroblaster for å oppnå den høyeste effektiviteten. Omprogrammere effektivitet er best med fibroblaster av passasje 2-4. Omprogrammere kan fortsatt arbeide med høy-passasjen (passasje 5-8), selv senescent fibroblaster, men med redusert effektivitet. Noen ganger lav-passasjen fibroblaster er utilgjengelig eller pasientprøvene har en genetisk mutasjon som hindrer sunn vekst. I dette tilfellet kan optimalisering av første plating være nødvendig. Omprogrammere kompromittert fibroblast linjer er vanligvis forbundet med økt celledød under RNA transfections. Resultatet vises cellene i den omprogrammering godt å være sparsommelig med dager 10-14 med reprogramming. Store acellular områder vil også vises i brønnen. Hvis dette er tilfelle, må reprogramming protokollen skal re startet med høyere første startnummeret av fibroblaster. Kontaktflate 3000 inn celler per brønn av en 6-vel format rett fungerer konsekvent for de fleste voksne fibroblast linjer. Imidlertid kan øke plating tallet 5 000 – 10 000 (50.000 for senescent linjer) bidra til å forbedre omprogrammering av sykdomsassosierte prøver, som er rapportert i våre tidligere publikasjoner8. Derimot kan celler nå confluency for tidlig også være motstandsdyktig mot omprogrammering. Hvis cellene gjennomgår transfections med reprogramming RNAs sprer for fort (som er tilfellet med primære neonatal fibroblaster), starte omprogrammering med 500 fibroblaster per brønn av en 6-vel format parabolen8.
Håndtering av transfection bufferen:
PH i transfection bufferen (redusert serum middels justert til pH i 8.2) er viktig for å oppnå optimal transfection effektiviteten kreves for dette omprogrammering protokollen. Derfor anbefales flere forholdsregler angående håndtering av transfection bufferen. Vi har funnet at selv kort eksponering for transfection bufferen atmosfærisk luft påvirker pH i bufferen. Derfor skal hva bufferen aliquoted i en skrukork beholder med minimal luftrommet (vi bruker 5 eller 15 mL skrukork konisk rør). Til ytterligere minimere luft eksponering, bruke hver transfection buffer aliquot for maksimalt to transfections. Til slutt, siden temperatur virkninger pH er det avgjørende at transfection bufferen er equilibrated å RT for montering av transfection komplekser. Det anbefales å ikke varm transfection buffer til 37 ° C.
Passaging av iPSCs:
Mens mange tidligere utgitt protokoller anbefaler plukke personlige iPSC kolonier på slutten av omprogrammering, dette kan være vanskelig å oppnå når effektiviteten av omprogrammering er svært høy eller hvis koloniene klynge sammen, som ofte er tilfelle i vår protokollen. IPSC kolonier ligger i umiddelbar nærhet til hverandre, anbefaler vi derfor først passaging cellene å spre omprogrammeres iPSCs før manuelt plukke kolonier. Det er flere fordeler med dette tidlig passering grepet. Spre ut koloniene gir mer plass til å vokse, gir mye større koloniene for plukking enn ellers kan oppnås i den opprinnelige brønnen. Dette forbedrer suksessrate i å etablere en iPSC linje fra en plukket klone. Vi finner også at flere kultur tiden med fibroblaster, om enn på en utvannet forhold, synes å forbedre den gjennomsnittlige kvaliteten på plukket iPSC kolonier. Ufullstendig omprogrammeres fibroblaster kan gi støtte paracrine faktorer, som fortsetter å etablere iPSCs og lette direkte overgangen i arkmateren uten celle kultur forhold. Fibroblaster har tilfeldig en selektiv vekst ulempe sammenlignet iPSCs når kultivert i mTeSR1. Derfor er forurensende fibroblast celle befolkningen raskt utvannet til ubetydelige mengder innen 3-4 ganger.
ROCK-hemmere som Y-27632 brukes ofte for rutinemessig kultur for menneskelig iPSCs. Vi har funnet at hyppige og/eller utvidet kultur noen iPSC linjer med Y-27632 får skadelige effekt på kvaliteten. Når du bruker en klynge passaging metoden, er som med EDTA, Y-27632 ikke nødvendig å opprettholde iPSC levedyktighet etter deling. Vi har helt eliminert supplere medier med Y-27632 for alle iPSC isolasjon, utvidelse eller rutinemessig kultur.
Protokollen begrensninger:
En begrensning til beskrevet RNA-baserte reprogramming tilnærming er innledende kostnader og kompleksitet knyttet til utarbeidelse av reprogramming reagenser. Selv om forberedende prosedyrer for å generere mRNA reagenser alle rutine og har vært tidligere beskrevet (PCR, i vitro transkripsjon, DNase behandling, capping, dephosphorylation, rensing), er kumulativt produksjon av mRNA reagenser en relativt lengre og ikke-triviell prosess. Den andre store utfordringen til denne protokollen er behovet for å transfect celler hver 48 h, øke arbeidskraft reprogramming protokollen. Disse hensynene kan være uoverkommelige hvis omprogrammering av bare noen pasientprøvene. Men hvis den primære vurderingen er generering av klinisk relevante iPSCs eller oppnå svært høy omprogrammering effektivitet, er beskrevet RNA-baserte reprogramming tilnærmingen ideelt.
Oppsummert hengsler beskrevet høyeffektive RNA-baserte reprogramming metoden på optimalisert transfection effektiviteten av hvilken somatisk cell må omprogrammeres som beskrevet i våre tidligere publikasjoner8. RNA transfection protokollen presentert i denne studien er svært innstilt for menneskelig primære fibroblaster men potensielt kan skreddersys til andre celletyper å forbedre omprogrammering effektiviteten av ulike somatiske celler.
The authors have nothing to disclose.
Vi er takknemlige for finansiering støtte fra National Institutes of Health (T32AR007411-33) og University of Colorado hud sykdommer forskning Core Center (P30AR057212). Vi takker også den Epidermolysis Bullosa (EB) Research Partnership, EB Forskningsstiftelse, kur EB veldedighet, Dystrophic Epidermolysis Bullosa Research Association (DEBRA) International, kong Baudouin stiftelsens Vlinderkindje Fund og porter Grenser fondet.
Plasmid templates for PCR | |||
pcDNA3.3_KLF4 | Addgene | 26815 | |
pcDNA3.3_SOX2 | Addgene | 26817 | |
pcDNA3.3_c-MYC | Addgene | 26818 | |
pcDNA3.3_LIN28A | Addgene | 26819 | |
pCR-Blunt_hM3O | Addgene | 112638 | |
pCR-Blunt_hNANOG | Addgene | 112639 | |
pCR-Blunt_mWasabi | Addgene | 112640 | |
Modified mRNA in vitro transcription and miRNA mimics | |||
Forward Primer | Integrated DNA Technologies | TTGGACCCTCGTACAGAAGC TAATACG |
|
Reverse Primer (Ordered as ultramer, 4nmol scale) | Integrated DNA Technologies | TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT CTTCCTACTCAGGCTTTATTCA AAGACCA |
|
(ARCA Cap) 3´-0-Me-m7G(5')ppp(5')G | New England Biolabs | S1411S | |
Pfu Ultra II Hotstart 2x Master Mix | Agilent | 600850-51 | |
5-Methylcytidine-5'-Triphosphate | Trilink Biotechnologies | N-1014 | |
Antarctic Phosphatase | New England Biolabs | M0289L | |
DNase I | NEB | M0303S | |
MEGAscript T7 Transcription Kit | ThermoFisher Scientific | AM1334 | |
Pseudouridine-5'-Triphosphate | Trilink Biotechnologies | N-1019 | |
Riboguard RNase Inhibitor | Lucigen | RG90910K | |
RNA Clean & Concentrator | ZymoResearch | R1019 | |
Syn-hsa-miR-302a-3p miScript miRNA Mimic | Qiagen | MSY0000684 | |
Syn-hsa-miR-302b-3p miScript miRNA Mimic | Qiagen | MSY0000715 | |
Syn-hsa-miR-302c-3p miScript miRNA Mimic | Qiagen | MSY0000717 | |
Syn-hsa-miR-302d-3p miScript miRNA Mimic | Qiagen | MSY0000718 | |
Syn-hsa-miR-367-3p miScript miRNA Mimic | Qiagen | MSY0000719 | |
Water (Nuclease free, Not DEPC-treated) | Fisher | AM9937 | Use to dilute modified mRNAs and miRNA mimics |
Fibroblast culture and reprogramming | |||
0.1% Gelatin in H2O | stemcell technologies | #07903 | |
Stericup-GV Sterile Vacuum Filtration System | EMD Millipore | SCGVU05RE | Use to sterilize the transfection buffer and 0.5 mM EDTA in DPBS |
2-Mercaptoethanol | ThermoFisher Scientific | 21985023 | |
6-well plates (tissue culture treated) | Corning | 3516 | |
DMEM/F12 | ThermoFisher Scientific | 11320033 | |
Fetal Bovine Serum | Fisher | 26-140-079 | |
FGF Basic | ThermoFisher Scientific | phg0263 | |
GlutaMax Supplement | ThermoFisher Scientific | 35050061 | Glutamine supplement used for the prepration of media |
Heat Inactivated FBS | Gibco Technologies | 10438026 | |
KnockOut Serum Replacement | ThermoFisher Scientific | 10828010 | |
Lipofectamine RNAiMAX Transfection Reagent | ThermoFisher Scientific | 13778500 | The protocol is optimized for the Lipofectamine RNAiMax transfection reagent |
MEM | ThermoFisher Scientific | 11095080 | |
MEM Non-essential amino acids | ThermoFisher Scientific | 11140050 | |
Opti-MEM I Reduced Serum Medium | ThermoFisher Scientific | 31985070 | Reduced-serum medium, use to make the transfection buffer by adjusting the pH to 8.2, 500 mL |
Opti-MEM I Reduced Serum Medium | ThermoFisher Scientific | 31985062 | Reduced-serum medium, use to make the transfection buffer by adjusting the pH to 8.2, 100 mL |
10 M NaOH | Sigma-Aldrich | 72068 | Make a 1 M solution by diluting in nuclease free water and use for pH adjustment |
Water (Nuclease free, Not DEPC-treated) | Fisher | AM9932 | Use to dilute NaOH and wash a pH meter |
Pen/Strep/Fungizone | GE Healthcare | SV30079.01 | |
rhLaminin-521 | ThermoFisher Scientific | A29248 | Supplied at a concentration of 100 µg/mL, use as a matrix for the reprogramming procedure |
Dulbecco's phosphate-buffered saline (DPBS) | Life Technologies | 14190144 | |
Trypsin-EDTA 0.25% Phenol Red | Life Technologies | 2520056 | |
Vaccinia Virus B18R (CF) | ThermoFisher Scientific | 34-8185-86 | |
iPSC culture | |||
Corning Matrigel hESC-Qualified Matrix | Corning | 354277 | Extracellular matrix (ECM) for culturing iPSCs |
EDTA, 0.5 M stock solution | K&D Medical | RGF-3130 | Dilute to 0.5 mM in DPBS, filter sterilize and use for iPSC passaging |
mTeSR1 | StemCell Technologies | 85850 | Pluripotent stem cell (PSC) medium, provides growth advantage to iPSCs over fibroblasts |
Antibodies and Detection | |||
Rabbit anti Mouse (HRP conjugated) | Abcam | ab97046 | |
Tra-1-60 (mouse anti human) | Stemgent | 09-0010 | |
Hydrogen Peroxide (30%) | LabChem | LC154301 | Dilute to 3% with PBS |
Bovine Serum Albumin (BSA) | Fisher | BP9703100 | |
Phosphate-buffered salin (PBS) | Hyclone | SH30258.02 | Supplied as 10x, dilute to 1x |
VECTOR NovaRED Peroxidase Substrate Kit | Vector Laboratories | SK-4800 | |
Special Equipment | |||
Description | Notes | ||
Biological safety cabinet | |||
Regular humidified tissue culture incubator | Calibrate CO2 using digital meter, fyrite, or equivalent. Equilibrate incubator to 5% CO2, 37°C. | ||
Tri-gas humidified tissue culture incubator | Calibrate CO2 using digital meter, fyrite, or equivalent. Equilibrate incubator to 5% CO2, 5% O2, 37°C. Use for the reprogramming procedure. | ||
pH Meter | Must have resolution to two decimal places. Designate to RNA work if possible. | ||
Inverted microscope | Microscope configured to visualize EGFP for monitoring transfection efficiency. |