Här beskriver vi en kliniskt relevant, hög verkningsgrad, feeder-fri metod att omprogrammera humana primära fibroblaster till inducerade pluripotenta stamceller använder modifierade mRNA kodning omplanering faktorer och mogen mikroRNA-367/302 härmar. Här ingår också metoder för att bedöma omplanering effektivitet, expandera klonal iPSC kolonier och bekräfta uttryck för pluripotens markören TRA-1-60.
Inducerade pluripotenta stamceller (iPSCs) har visat sig vara ett värdefullt verktyg att studera människans utveckling och sjukdom. Ytterligare främja iPSCs som en regenerativ terapeutiska kräver en säker, robust, och ändamålsenligt omplanering protokoll. Här presenterar vi ett kliniskt relevant, stegvisa protokoll för extremt hög verkningsgrad omprogrammering av mänskliga dermal fibroblaster in iPSCs använder ett icke-integrerande tillvägagångssätt. Kärnan i protokollet består av att uttrycka pluripotency faktorer (SOX2, KLF4, cMYC, LIN28A, NANOG, OCT4-MyoD fusion) från in vitro- transkriberas messenger RNA syntetiseras med modifierat nukleotider (modifierade mRNA). De omprogrammering modifierade mRNA är transfekterade till primära fibroblaster varje 48 h tillsammans med mogen embryonala stamceller-specifika mikroRNA-367/302 härmar i två veckor. De resulterande iPSC kolonierna kan sedan isoleras och direkt expanderat i feeder-fria villkor. För att maximera effektivitet och konsekvens i våra omplanering protokoll över fibroblast prover, vi har optimerat olika parametrar, bland annat den RNA transfection regimen, timing av transfections, odlingsbetingelser och sådd tätheter. Ännu viktigare, genererar vår metod högkvalitativa iPSCs från de flesta fibroblast källor, inklusive svårt-att-programmera sjuka, äldre eller senescent prover.
Omprogrammering av somatiska celler in i inducerade pluripotenta stamceller (iPSCs) kräver utökade uttryck för en grundläggande uppsättning transkriptionsfaktorer som är viktiga att upprätthålla pluripotency1,2. Vid framställning av iPSCs för kliniska tillämpningar, är det viktigt att mutationsanalys bördan i indataceller minimeras under bearbetning och effektiviteten i iPSC generation upprätthålls på en relativt hög nivå över patientprover. Men lider majoriteten av omprogrammering metoder, inklusive integration-fritt protokoll, av mycket låga omplanering effektivitetsvinster, vilken gräns kliniska nyttan av dessa närmar sig3. Låga omplanering effektivitet kan också främja selektiva omprogrammering av celler som bär redan existerande mutationer, ökar mutationsanalys börda i resulterande iPSCs. Dessutom lider alla DNA-baserade omplanering metoder, såsom lentivirus – och episomal-baserade metoder, den säkerhet oro att DNA slumpmässigt kan integrera i genomet och skapa möjlighet för skadliga insertionsmutationer och oönskade ( potentiellt onkogena) uttryck för pluripotens gener i nedströms vävnad derivat4.
En lovande strategi för att uppnå effektiv induktion av pluripotency i somatiska celler och minska mutationsanalys börda i resulterande iPSCs är att använda syntetiska utjämnade messenger RNAs som innehåller modifierade nucleobases (modifierade mRNA) för omprogrammering5. Effektiviteten av modifierade mRNA omplanering tillvägagångssätt kan förbättras ytterligare genom att lägga till embryonala stamceller (ESC)-specifika mikroRNA (Mirna) -367/302s3, som har visat att omprogrammera kroppsceller med ökad effektivitet6 ,7. Men även med tillägget av Mirna-367/302s misslyckas den modifierade mRNA omplanering synsätt ofta under applicering till nybakade isolerade patientens celler3. Till adress inkonsekvenser i denna modifierade mRNA-baserade strategi, har vi nyligen rapporterat en optimerad, integration-gratis strategi som inducerar pluripotency i mänskliga primära fibroblaster med en hög framgång och använder båda modifierade mRNA kodning omprogrammering faktorer och mogen miRNA-367/302 härmar8. I vår metod innehåller omplanering modifierade mRNA cocktail en modifierad version av OCT4 som smält med MyoD transkription domänen (kallas M3O)9 och fem andra omplanering faktorer (SOX2, KLF4, cMYC, LIN28A och NANOG). Att kombinera modifierade mRNA kodning pluripotency faktorer med miRNA tycktes härmar ha en synergistisk effekt på omprogrammering effektivitetsvinster i detta protokoll. Ytterligare optimeringar av RNA transfection regimen, cell sådd och odling villkorar var också nödvändigt att öka omplanering effektiviteten i metoden till en extremt hög nivå8.
Till skillnad från många andra protokoll kräver vår omplanering tillvägagångssätt normalt endast några tusen ingående fibroblaster. Dessutom innebära många gemensamma icke-integrerande strategier använder episomal plasmider, Sendai virus eller självreplikerande RNA omfattande passaging för att späda ut den omprogrammering vektorn i genererade iPSCs. Omvänt, modifierade mRNA och mogen miRNA härmar har en kort halveringstid och elimineras snabbt från celler. Sammantaget den kumulativa cell kulturtid mellan patientprover och generering av användbara iPSCs är minimal i detta tillvägagångssätt, att effektivt begränsa mutation ackumulering i resulterande iPSCs och förbättra kostnadseffektiviteten.
Här presenterar vi detaljerade stegvisa protokollet för att uppnå hög verkningsgrad omprogrammering av vuxen mänskliga fibroblaster in iPSCs använder våra kombinatoriska modifierade mRNA/miRNA-baserad metod8. Detta RNA-baserade omplanering protokoll ger en enkel, kostnadseffektiv och robust metod för att skapa integration-fri iPSCs för forskning och potentiella kliniska tillämpningar. Dessutom gäller det en omprogrammering av en mängd fibroblast linjer inklusive svårt-att-programmera, sjukdomsassocierade, åldern, och senescent fibroblaster. En schematisk för protokollet för omprogrammering mänskliga fibroblaster visas i figur 1. Protokollet beskrivs specifikt en metod för omprogrammering tre brunnar av mänskliga vuxen primär fibroblaster i en 6-väl format plattan. Två brunnar ger normalt ett tillräckligt antal högkvalitativa iPSC kolonier. I många fall bara en är väl nödvändiga, och tredje väl kan användas för analys av omprogrammering effektivitet. Om det behövs kan antalet brunnar skalas upp.
Det här protokollet beskriver en kliniskt relevant, icke-integrering, RNA-baserad metod som möjliggör för omprogrammering av normala och sjukdomsassocierade mänskliga fibroblast linjer till iPSCs på en extremt hög verkningsgrad. Hittills har varje mänsklig fibroblast linje har vi försökt att programmera med protokollet beskrivs gett ett tillfredsställande antal högkvalitativa iPSCs för nedströms tillämpningar. Resulterande iPSCs kan omedelbart överföras och expanderat i feeder-fri odlingsbetingelser.
Kvalitet av fibroblaster för omprogrammering:
Omprogrammering framgång är starkt beroende av kvaliteten på Start fibroblaster. Idealiskt, omprogrammering initieras med lägsta passage fibroblaster att uppnå högsta möjliga effektivitet. Omprogrammering effektivitet är bäst med fibroblaster av passage 2 – 4. Omprogrammering kan fortfarande arbeta med hög-passagen (passage 5 – 8), även senescent fibroblaster, om än med en minskad effektivitet. Ibland låg-passage fibroblaster är otillgänglig eller patientprover har en genetisk mutation som förhindrar tillväxt. I det här fallet, kan optimering av inledande plätering densitet krävas. Omprogrammering av komprometterad fibroblast linjer är vanligtvis förknippas med ökad celldöd under RNA transfections. Som ett resultat, verkar cellerna i en omprogrammering väl vara glesa av 10 – 14 dagars omprogrammering. Stora acellulärt områden kommer också att visas i brunnen. Om så är fallet, behöver omplanering protokollet återupptas med ett högre inledande tal av fibroblaster. Plätering 3.000 indataceller per brunn av en 6-väl format maträtt arbetar konsekvent för de flesta vuxna fibroblast linjer. Dock kan ökar plätering nummer 5 000 – 10 000 (50.000 för senescent linjer) bidra till att förbättra omprogrammering av sjukdomsassocierade prover, vilket har rapporterats i vår föregående publikation8. Celler att nå konfluens för tidigt kan däremot också vara resistent mot omprogrammering. Om celler som genomgår transfections med omprogrammering RNAs föröka alltför snabbt (vilket ibland är fallet med primära neonatal fibroblaster) inleda omprogrammering med 500 fibroblaster per brunn av en 6-väl format maträtt8.
Hantering av transfection bufferten:
PH-värdet i transfection bufferten (minskad-serum medium justerat till pH 8,2) är avgörande för att uppnå optimal transfection effektivitetsvinsterna krävs för detta omprogrammering protokoll. Av denna anledning rekommenderas flera försiktighetsåtgärder avseende hanteringen av transfection bufferten. Vi har funnit att även korta exponering transfection bufferten för Atmosfärisk luft påverkar pH i bufferten. Transfection bufferten bör därför aliquoted i en behållare med skruvlock med minimal luftar utrymme (vi använder antingen 5 eller 15 mL skruvlock koniska rör). För att ytterligare minimera luft exponering, använda varje transfection buffert alikvotens för högst två transfections. Slutligen, sedan temperaturen påverkar pH är det kritiskt att transfection bufferten är utjämnad RT för montering av transfection komplexen. Det är klokt att inte värma transfection bufferten till 37 ° C.
Passaging av iPSCs:
Medan många publicerade tidigare protokoll rekommenderar plocka enskilda iPSC kolonier i slutet av omprogrammering, detta kan vara svårt att uppnå när effektiviteten av omprogrammering är mycket hög eller om kolonierna kluster tillsammans, som ofta är fallet i våra protokoll. Om iPSC kolonier är i närheten av varandra, rekommenderar vi först passaging cellerna att sprida ut omprogrammerade iPSCs innan manuellt plocka kolonier. I området i närheten finns det flera fördelar med att utföra detta tidiga passage steg. Sprider ut kolonierna ger dem mer utrymme att växa, vilket ger mycket större kolonier för plockning än annars skulle kunna uppnås i den ursprungliga väl. Detta förbättrar avsevärt framgång i upprättandet av en iPSC linje från en plockade klon. Vi tycker också att ytterligare kultur tiden med fibroblaster, om än i förhållandet utspädda, visas att förbättra den genomsnittliga kvaliteten på plockade iPSC kolonier. Ofullständigt omprogrammerade fibroblaster kan ge stödjande parakrin faktorer, som fortsätter för att upprätta iPSCs och underlätta direkta övergången till feeder-fri cell odlingsbetingelser. Fibroblaster har slump en selektiv tillväxt nackdel jämfört iPSCs när odlade i mTeSR1. Kontaminerande fibroblast cell befolkningen späds därför snabbt till försumbara mängder inom 3 – 4 passager.
ROCK-hämmare såsom Y-27632 används ofta för rutinmässig kultur av mänskliga iPSCs. Vi har funnit att frekventa eller förlängda kultur av vissa iPSC linjer med Y-27632 kan ha skadliga effekter på kvaliteten. När du använder en dunge passaging metod, är som med EDTA, Y-27632 inte nödvändigt att upprätthålla iPSC lönsamhet efter klyvning. Vi har helt elimineras komplettera media med Y-27632 för alla iPSC isolering, expansion eller rutinmässiga kultur.
Protokoll begränsningar:
En begränsning att den beskrivna RNA-baserade omplanering strategin är initiala kostnaden och komplexiteten som är associerad med förberedelsen av omplanering reagenserna. Även om förberedande förfaranden att generera mRNA reagenser är alla rutin och har tidigare beskrivits (PCR, in vitro- transkription, DNase behandling, tak, Defosforylering, rening), är kumulativt produktionen av mRNA reagenser en relativt utdragen och icke-trivial process. Den andra stora utmaningen i detta protokoll är behovet av att transfect celler varje 48 h, öka labor intensiteten av protokollet omplanering. Dessa överväganden kan vara oöverkomliga om omprogrammering av endast några patientprover önskas. Om det främsta övervägandet är framtagning av kliniskt relevanta iPSCs eller uppnå mycket hög omplanering effektivitet, är dock den beskrivna RNA-baserade omplanering metoden perfekt.
Sammanfattningsvis gångjärn den beskrivna högeffektiv RNA-baserade omplanering metoden på optimerad transfection effektivitet av somatisk typ omprogrammeras som beskrivs i våra tidigare publikation8. RNA transfection protokollet presenteras i denna studie är mycket trimmad för mänskliga primära fibroblaster men potentiellt kan anpassas till andra celltyper att förbättra omplanering effektiviteten av olika somatiska celler.
The authors have nothing to disclose.
Vi är tacksamma för finansiellt stöd från National Institutes of Health (T32AR007411-33) och University of Colorado hud sjukdomar Research Core Center (P30AR057212). Vi tackar också Epidermolysis Bullosa (EB) forskning partnerskapet, EB Medical Research Foundation, bota EB välgörenhet, dystrofa Epidermolysis Bullosa Research Association (DEBRA) International, King Baudouin Foundation’s Vlinderkindje fonden, och Gates Gränser fonden.
Plasmid templates for PCR | |||
pcDNA3.3_KLF4 | Addgene | 26815 | |
pcDNA3.3_SOX2 | Addgene | 26817 | |
pcDNA3.3_c-MYC | Addgene | 26818 | |
pcDNA3.3_LIN28A | Addgene | 26819 | |
pCR-Blunt_hM3O | Addgene | 112638 | |
pCR-Blunt_hNANOG | Addgene | 112639 | |
pCR-Blunt_mWasabi | Addgene | 112640 | |
Modified mRNA in vitro transcription and miRNA mimics | |||
Forward Primer | Integrated DNA Technologies | TTGGACCCTCGTACAGAAGC TAATACG |
|
Reverse Primer (Ordered as ultramer, 4nmol scale) | Integrated DNA Technologies | TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT CTTCCTACTCAGGCTTTATTCA AAGACCA |
|
(ARCA Cap) 3´-0-Me-m7G(5')ppp(5')G | New England Biolabs | S1411S | |
Pfu Ultra II Hotstart 2x Master Mix | Agilent | 600850-51 | |
5-Methylcytidine-5'-Triphosphate | Trilink Biotechnologies | N-1014 | |
Antarctic Phosphatase | New England Biolabs | M0289L | |
DNase I | NEB | M0303S | |
MEGAscript T7 Transcription Kit | ThermoFisher Scientific | AM1334 | |
Pseudouridine-5'-Triphosphate | Trilink Biotechnologies | N-1019 | |
Riboguard RNase Inhibitor | Lucigen | RG90910K | |
RNA Clean & Concentrator | ZymoResearch | R1019 | |
Syn-hsa-miR-302a-3p miScript miRNA Mimic | Qiagen | MSY0000684 | |
Syn-hsa-miR-302b-3p miScript miRNA Mimic | Qiagen | MSY0000715 | |
Syn-hsa-miR-302c-3p miScript miRNA Mimic | Qiagen | MSY0000717 | |
Syn-hsa-miR-302d-3p miScript miRNA Mimic | Qiagen | MSY0000718 | |
Syn-hsa-miR-367-3p miScript miRNA Mimic | Qiagen | MSY0000719 | |
Water (Nuclease free, Not DEPC-treated) | Fisher | AM9937 | Use to dilute modified mRNAs and miRNA mimics |
Fibroblast culture and reprogramming | |||
0.1% Gelatin in H2O | stemcell technologies | #07903 | |
Stericup-GV Sterile Vacuum Filtration System | EMD Millipore | SCGVU05RE | Use to sterilize the transfection buffer and 0.5 mM EDTA in DPBS |
2-Mercaptoethanol | ThermoFisher Scientific | 21985023 | |
6-well plates (tissue culture treated) | Corning | 3516 | |
DMEM/F12 | ThermoFisher Scientific | 11320033 | |
Fetal Bovine Serum | Fisher | 26-140-079 | |
FGF Basic | ThermoFisher Scientific | phg0263 | |
GlutaMax Supplement | ThermoFisher Scientific | 35050061 | Glutamine supplement used for the prepration of media |
Heat Inactivated FBS | Gibco Technologies | 10438026 | |
KnockOut Serum Replacement | ThermoFisher Scientific | 10828010 | |
Lipofectamine RNAiMAX Transfection Reagent | ThermoFisher Scientific | 13778500 | The protocol is optimized for the Lipofectamine RNAiMax transfection reagent |
MEM | ThermoFisher Scientific | 11095080 | |
MEM Non-essential amino acids | ThermoFisher Scientific | 11140050 | |
Opti-MEM I Reduced Serum Medium | ThermoFisher Scientific | 31985070 | Reduced-serum medium, use to make the transfection buffer by adjusting the pH to 8.2, 500 mL |
Opti-MEM I Reduced Serum Medium | ThermoFisher Scientific | 31985062 | Reduced-serum medium, use to make the transfection buffer by adjusting the pH to 8.2, 100 mL |
10 M NaOH | Sigma-Aldrich | 72068 | Make a 1 M solution by diluting in nuclease free water and use for pH adjustment |
Water (Nuclease free, Not DEPC-treated) | Fisher | AM9932 | Use to dilute NaOH and wash a pH meter |
Pen/Strep/Fungizone | GE Healthcare | SV30079.01 | |
rhLaminin-521 | ThermoFisher Scientific | A29248 | Supplied at a concentration of 100 µg/mL, use as a matrix for the reprogramming procedure |
Dulbecco's phosphate-buffered saline (DPBS) | Life Technologies | 14190144 | |
Trypsin-EDTA 0.25% Phenol Red | Life Technologies | 2520056 | |
Vaccinia Virus B18R (CF) | ThermoFisher Scientific | 34-8185-86 | |
iPSC culture | |||
Corning Matrigel hESC-Qualified Matrix | Corning | 354277 | Extracellular matrix (ECM) for culturing iPSCs |
EDTA, 0.5 M stock solution | K&D Medical | RGF-3130 | Dilute to 0.5 mM in DPBS, filter sterilize and use for iPSC passaging |
mTeSR1 | StemCell Technologies | 85850 | Pluripotent stem cell (PSC) medium, provides growth advantage to iPSCs over fibroblasts |
Antibodies and Detection | |||
Rabbit anti Mouse (HRP conjugated) | Abcam | ab97046 | |
Tra-1-60 (mouse anti human) | Stemgent | 09-0010 | |
Hydrogen Peroxide (30%) | LabChem | LC154301 | Dilute to 3% with PBS |
Bovine Serum Albumin (BSA) | Fisher | BP9703100 | |
Phosphate-buffered salin (PBS) | Hyclone | SH30258.02 | Supplied as 10x, dilute to 1x |
VECTOR NovaRED Peroxidase Substrate Kit | Vector Laboratories | SK-4800 | |
Special Equipment | |||
Description | Notes | ||
Biological safety cabinet | |||
Regular humidified tissue culture incubator | Calibrate CO2 using digital meter, fyrite, or equivalent. Equilibrate incubator to 5% CO2, 37°C. | ||
Tri-gas humidified tissue culture incubator | Calibrate CO2 using digital meter, fyrite, or equivalent. Equilibrate incubator to 5% CO2, 5% O2, 37°C. Use for the reprogramming procedure. | ||
pH Meter | Must have resolution to two decimal places. Designate to RNA work if possible. | ||
Inverted microscope | Microscope configured to visualize EGFP for monitoring transfection efficiency. |