Evaluering af samspillet mellem komplement protein C1q og hyaluronsyre i fremme celle vedhæftning

Summary

Komplement komponenten C1q er et Pro-inflammatorisk molekyle, der er stærkt udtrykt i vævs mikromiljøet, som kan interagere med den ekstracellulære matrix. Her beskriver vi en metode til at teste, hvordan C1q bundet til hyaluronsyre påvirker celle vedhæftning.

Abstract

Det er blevet mere og mere påvist, at tumormikromiljøet spiller en aktiv rolle i neoplasi vækst og metastaser. Gennem forskellige veje, kan tumorceller effektivt rekruttere stromale, immun og endotelceller ved at udskille stimulerende faktorer, chemokiner og cytokiner. Disse celler kan til gengæld ændre mikromiljøets signalerings egenskaber ved at frigive vækstfremmende signaler, metabolitter og ekstracellulære matrixkomponenter for at opretholde høj spredning og metastatisk kompetence. I denne sammenhæng, vi identificere, at komplement komponenten C1q, højt udtrykt lokalt ved en række af menneskelige Maligne tumorer, ved interaktion med den ekstracellulære matrix hyaluronsyre, stærkt påvirker adfærden af primære celler isoleret fra menneskelig tumor Prøver. Her beskriver vi en metode til at teste, hvordan C1q bundet til hyaluronsyre (HA) påvirker tumor celle vedhæftning, underliggende det faktum, at de biologiske egenskaber af centrale komponenter i den ekstracellulære matrix (i dette tilfælde HA) kan formes af bioaktive signaler mod tumor Progression.

Introduction

Tumor mikromiljø (TME) påvirker kræft udvikling og progression, da det kan give en eftergivende niche for celle overlevelse, vækst og invasion. Identifikationen af nye nøgleaktører i TME kan være nyttig for opdagelsen af nye molekylære værktøjer til Target terapi. TME omfatter et komplekst og dynamisk netværk af ikke-maligne celler, såsom endotelceller, fibroblaster og celler i immunsystemet, indlejret i den omgivende ekstracellulære matrix (ECM) komponenter, herunder collagens, lamininer, fibronectiner, proteoglycaner og hyaluronans. Både tumor og ikke-tumorceller syntetisere og udskille ECM komponenter sammen med cytokiner, chemokiner, vækstfaktorer og inflammatoriske og matrix remodeling enzymer, der generelt ændre de fysiske, kemiske og signalering egenskaber af TME. Blandt disse bestanddele, hyaluronsyre (HA) er dukket op for at udøve en afgørende rolle i tumor biologi. På trods af sin enkle kemiske sammensætning, HA, sammen med sine HA-bindende molekyler (hyalvedere), kan modulerangiogenese, immunsystemet reaktionsevne og ECM remodeling i en størrelse og koncentration afhængige måde¹.

Komplementsystemet (C) er også en del af den lokale TME, som for nylig har fået øget opmærksomhed. C-systemet omfatter et sæt af opløselige og membran bundne proteiner, der er involveret i den første forsvarslinje mod ikke-selv-celler, uønskede værts elementer og patogener. Funktionelt, C forbinder de to-effektor arme af medfødte og adaptive systemer til at fremme enten direkte celle drab eller montering af en inflammatorisk respons². C aktivering kan undertrykke tumorvækst, ved at ødelægge kræftceller eller hæmme deres outgrowth, men det er blevet stadig tydeligere, at det kan besidde en tumor-fremme aktivitet ved at opretholde kronisk betændelse, fremme oprettelsen af en immunsuppressiv Milieu, inducerende angiogenese og aktivering af kræftrelaterede signalerings veje³. I denne sammenhæng, C1q, den første anerkendelse molekyle af den klassiske vej af C-systemet er dukket op til at udøve vigtige funktioner i tumoren mikromiljø uafhængigt af C aktivering⁴. C1q har vist sig at være udtrykt lokalt af en række af menneskelige Maligne tumorer, hvor det kan favorisere kræft celle vedhæftning, migration og spredning i tillæg til angiogenese og metastase⁵. Interessant C1q interagerer med en stor bestanddel af ECM som HA.

Vi udviklede en teknik til at isolere de primære kræftceller fra tumor massen. Desuden har vi skabt matrixen, som kan stimulere tumor mikromiljø, især samspillet mellem C1q og høj molekylvægt hyaluronsyre. C1q bundet til HA var i stand til at fremkalde vedhæftning af tumorceller.

Protocol

Vævsprøver fra patienter blev indsamlet efter informeret samtykke efter godkendelse af de etiske overvejelser i det institutionelle Råd på universitetshospitalet i Trieste, Italien. 1. tumor celle isolation og kultur (dag 1) Isoler humane Mesotheliom celler fra MPM solide prøver. Vævet skal finjusteres med en fræser for at opnå fragmenter på ca. 2-3 mm2 i størrelse og inkube i 5 ml fordøjelsesvæske, der er sammensat af Hanks ‘ balanceret salt opløsning (HBSS) …

Representative Results

HA er et negativt ladet polysaccharid med høj molekylvægt, som består af gentagne (β, 1-4)-D-glucuronsyre-(β, 1-3)-N-acetyl-l-glucosamin disaccharid enheder (figur 1b)7. Forekomsten af binding af HA på 96-brønd pladen samt effektiviteten af dens immobilisering blev testet ved at drage fordel af biotinylated HA (Bio-HA). Forskellige koncentrationer af bio-HA, der spænder fra 10 μg/mL til 1 mg/mL, blev resuspenderet i 100 mM kar…

Discussion

Vi beskriver en nem metode til at undersøge, hvordan komplement komponenten C1q, interagere med hyaluronsyre, er i stand til at moduere opførsel af primærceller isoleret fra humant tumor væv. Både HA og C1q er rigeligt til stede i vævet mikromiljø både under fysiologiske og patologiske betingelser, der deltager i flere celle biologiske processer. For eksempel har C1q vist sig at være til stede i mikromiljøet af placenta, hvor det favoriserer ekstrvillous trofoblast invasion af moderen lærk under placentation<s…

Materials

100 µm pore filter	BD Falcon	352360
Amphotericin B solution (fungizone)	Sigma-Aldrich	1397-89-3
basic FGF	Immunological Sciences	GRF-15595
Calcium Chloride	Sigma-Aldrich	C-4901
Collagenase type I	Worthington Biochemical Corporation, DBA	MX1D12644
D-Glucose	Sigma-Aldrich	50-99-7
DNase I	Roche	10 104 159 001
EDTA	Sigma-Aldrich	60-00-4
EGF	Immunological Sciences	GRF-10544
FAST DiI	Molecular probes, Invitrogen, Thermo Fisher Scientific	D7756
Fetal bovine serum	Gibco,  Thermo Fisher Scientific	10270-106
Fibronectin	Roche	11051407001
Flask for cell culture	Corning	430639	Sterile, vented
Gentamicin solution	Sigma-Aldrich	G1397-10ML
Hank’s Balanced Salt Solution (HBBS)	Sigma-Aldrich	H6648	Supplemented with EDTA, Glucose, penicillin-streptamicin, gentamicin and fungizone
High molecular weight hyaluronic acid	Kind gift by Prof. Ivan Donati
Human endothelial serum free medium	Gibco,  Thermo Fisher Scientific	11111-044	Supplemented with EGF (5 ng/mL), basic FGF (10 ng/mL), and  1% penicillin–streptomycin (Sigma-Aldrich)
Magnesium Chloride	Carlo Erba	13446-18-9
Medium 199 with Hank’s salt	Sigma-Aldrich	M7653
Penicillin-Streptomycin	Sigma-Aldrich	P0781
Time-lapse microscopy	Nikon	Imaging System BioStation IM-Q
Titertek Multiskan ELISA Reader	Flow Labs
Trypsin	Sigma-Aldrich	T4674