Utvärdering av samspelet mellan komplement proteinet C1q och hyaluronsyra för att främja celladhesion

Summary

Komplement komponenten C1q är en Pro-inflammatorisk molekyl som uttrycks högt i den vävnads mikromiljö som kan interagera med den extracellulära matrisen. Här beskriver vi en metod för att testa hur C1q bunden till hyaluronsyra påverkar cellernas vidhäftning.

Abstract

Det har blivit alltmer visat att tumören mikromiljö spelar en aktiv roll i neoplasi tillväxt och metastaser. Genom olika vägar, kan tumör celler effektivt rekrytera stromal, immun och endotelceller genom att utsöndra stimulatoriska faktorer, chemokiner och cytokiner. I sin tur kan dessa celler ändra signaleringsegenskaper för mikromiljön genom att frigöra tillväxt främjande signaler, metaboliter och extracellulära matrix komponenter för att upprätthålla hög spridning och metastaserande kompetens. I detta sammanhang, vi identifierar att komplement komponenten C1q, högt uttryckt lokalt av en rad mänskliga maligna tumörer, på interagerar med extracellulär matrix hyaluronsyra, påverkar starkt beteendet hos primära celler isolerade från mänsklig tumör Exemplar. Här beskriver vi en metod för att testa hur C1q bunden till hyaluronsyra (HA) påverkar tumör cellernas vidhäftning, underliggande det faktum att de biologiska egenskaperna hos viktiga komponenter i den extracellulära matrisen (i detta fall HA) kan formas av bioaktiva signaler mot tumör Progression.

Introduction

Tumören mikromiljö (TME) påverkar cancer utveckling och progression eftersom det kan ge en tillåtande nisch för cell överlevnad, tillväxt och invasion. Identifieringen av nya nyckel aktörer i TME kan vara till nytta för upptäckten av nya molekyl ära verktyg för mål terapi. TME innehåller ett komplext och dynamiskt nätverk av icke-maligna celler, såsom endotelceller, fibroblaster och celler i immun systemet, inbäddade i den omgivande extracellulära matrix (ECM) komponenter inklusive kollagener, lamininer, fibronectiner, proteoglykaner och hyaluronans. Både tumör och icke-tumör celler syntetisera och utsöndra ECM komponenter tillsammans med cytokiner, chemokines, tillväxtfaktorer och inflammatoriska och Matrix remodeling enzymer som totalt förändrar den fysiska, kemiska och signalering egenskaper TME. Bland dessa bestånds delar, hyaluronsyra (HA) har vuxit fram för att utöva en avgörande roll i tumör bio Logi. Trots sin enkla kemiska sammansättning, HA, tillsammans med dess HA-bindande molekyler (hyaladherins), kan modulera angiogenes, immun systemet lyhördhet och ECM remodeling i en storlek och koncentrations beroende sätt¹.

Komplement (C) systemet är också en del av den lokala TME, som nyligen har fått ökad uppmärksamhet. C-systemet omfattar en uppsättning lösliga och membran-bundna proteiner som deltar i den första försvars linjen mot icke-Self-celler, oönskade värd element och patogener. Funktionellt, förbinder C de två effektor armarna av medfödda och adaptiva system för att främja antingen direkt cell dödande eller montering av en inflammatorisk reaktion². C aktivering kan undertrycka tumör tillväxt, genom att förstöra cancer celler eller hämma deras utväxt, men det har blivit allt tydligare att det kan ha en tumör-främjande verksamhet genom att upprätthålla kronisk inflammation, främja inrättandet av en immunosuppressiv miljö, inducera angiogenes och aktivera cancerrelaterade signal vägar³. I detta sammanhang, C1q, den första erkännande molekylen av den klassiska vägen av C-systemet har uppstått för att utöva viktiga funktioner i tumören mikromiljö oberoende av C aktivering⁴. C1q har visat sig uttryckas lokalt av en rad mänskliga maligna tumörer, där det kan gynna cancer cell adhesion, migration och proliferation utöver angiogenes och metastaser⁵. Intressant C1q interagerar med en viktig bestånds del i ECM som HA.

Vi utvecklade en teknik för att isolera de primära cancer cellerna från tumör massan. Dessutom skapade vi matrisen, som kan stimulera tumör mikromiljö, särskilt samspelet mellan C1q och hög molekyl vikt hyaluronsyra. C1q bunden till HA kunde inducera vidhäftning av tumör cellerna.

Protocol

Vävnads prov från patienter samlades in efter informerat samtycke efter godkännande av etiska överväganden av institutions styrelsen vid Universitetssjukhuset i Trieste, Italien. 1. tumör cell isolering och kultur (dag 1) Isolera humana mesoteliom celler från MPM fasta prover. Finhacka vävnaden med en fräs för att få fragment av ca 2-3 mm2 i storlek och inkubera i 5 ml mat smältnings lösning bestående av Hanks bal anse rad saltlösning (Hbss) kompletterad med…

Representative Results

HA är en negativt laddad hög molekyl vikt polysackanod, som består av upprepande (β, 1-4)-D-glukuronsyra-(β, 1-3)-N-acetyl-D-glukosamin disackarid enheter (figur 1b)7. Förekomsten av bindningen av HA på 96-brunnen plattan samt effektiviteten i dess immobilisering testades dra nytta av biotinylated HA (bio-HA). Olika koncentrationer av bio-HA, alltifrån 10 μg/mL till 1 mg/mL, återsuspenderas i 100 mM karbonat/bikarbonatbuffert…

Discussion

Vi beskriver en enkel metod för att undersöka hur komplement komponenten C1q, som interagerar med hyaluronsyra, kan modulera beteendet hos primära celler isolerade från mänskliga tumör vävnader. Både HA och C1q är rikligt närvarande i vävnaden mikromiljö både under fysiologiska och sjukdoms tillstånd, deltar i flera cell biologiska processer. Till exempel, C1q har visat sig vara närvarande i mikromiljön av moderkakan där det gynnar extravillous trofoblaster invasion av moderns decidua under placentation<…

Materials

100 µm pore filter	BD Falcon	352360
Amphotericin B solution (fungizone)	Sigma-Aldrich	1397-89-3
basic FGF	Immunological Sciences	GRF-15595
Calcium Chloride	Sigma-Aldrich	C-4901
Collagenase type I	Worthington Biochemical Corporation, DBA	MX1D12644
D-Glucose	Sigma-Aldrich	50-99-7
DNase I	Roche	10 104 159 001
EDTA	Sigma-Aldrich	60-00-4
EGF	Immunological Sciences	GRF-10544
FAST DiI	Molecular probes, Invitrogen, Thermo Fisher Scientific	D7756
Fetal bovine serum	Gibco,  Thermo Fisher Scientific	10270-106
Fibronectin	Roche	11051407001
Flask for cell culture	Corning	430639	Sterile, vented
Gentamicin solution	Sigma-Aldrich	G1397-10ML
Hank’s Balanced Salt Solution (HBBS)	Sigma-Aldrich	H6648	Supplemented with EDTA, Glucose, penicillin-streptamicin, gentamicin and fungizone
High molecular weight hyaluronic acid	Kind gift by Prof. Ivan Donati
Human endothelial serum free medium	Gibco,  Thermo Fisher Scientific	11111-044	Supplemented with EGF (5 ng/mL), basic FGF (10 ng/mL), and  1% penicillin–streptomycin (Sigma-Aldrich)
Magnesium Chloride	Carlo Erba	13446-18-9
Medium 199 with Hank’s salt	Sigma-Aldrich	M7653
Penicillin-Streptomycin	Sigma-Aldrich	P0781
Time-lapse microscopy	Nikon	Imaging System BioStation IM-Q
Titertek Multiskan ELISA Reader	Flow Labs
Trypsin	Sigma-Aldrich	T4674