स्वाइन पूरे रक्त में व्यक्त कोडिंग और गैर कोडिंग आरएनए कक्षाओं की पहचान
Summary
यहां, हम एक एकल पूरे रक्त नमूना से ग्लोबिन कम आरएनए-seq पुस्तकालयों के कोडिंग (mRNA) और गैर कोडिंग (ncRNA) के प्रसंस्करण के लिए अनुकूलित एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं ।
Abstract
अभिनव और तेजी से शक्तिशाली अगली पीढ़ी sequencing तकनीक के आगमन के लिए अंतर्निहित जीन ब्याज की जैविक प्रक्रियाओं से संबंधित अभिव्यक्ति की जांच करने की क्षमता में नए रास्ते खोल दिया है । इन नवाचारों न केवल शोधकर्ताओं mRNA अनुक्रम से अभिव्यक्ति का निरीक्षण करने की अनुमति है कि जीन के लिए कोड है कि प्रभाव सेलुलर समारोह, लेकिन यह भी गैर कोडिंग आरएनए (ncRNA) अणु है कि untranslated रहते हैं, लेकिन अभी भी विनियामक कार्य किया है । हालांकि शोधकर्ताओं ने दोनों mRNA और ncRNA अभिव्यक्ति का निरीक्षण करने की क्षमता है, यह एक अध्ययन के लिए एक या दूसरे पर ध्यान केंद्रित करने के लिए किया गया है । हालांकि, जब अध्ययन दोनों mRNA और ncRNA अभिव्यक्ति में रुचि रखते हैं, कई बार वे अलग नमूनों का उपयोग करने के लिए या तो कोडिंग या गैर कोडिंग पुस्तकालय की तैयारी में अंतर के कारण RNAs । यह समय, उपभोग्य सामग्रियों, और जानवरों के तनाव को बढ़ा सकते हैं जो अधिक नमूनों के लिए की जरूरत के लिए नेतृत्व कर सकते हैं । इसके अतिरिक्त, यह शोधकर्ताओं के लिए केवल एक विश्लेषण के लिए नमूने तैयार करने का फैसला करने के लिए कारण हो सकता है, आमतौर पर mRNA, जैविक प्रश्नों की संख्या सीमित है कि जांच की जा सकती है । हालांकि, ncRNAs mRNA अभिव्यक्ति प्रभाव नियामक भूमिकाओं के साथ एकाधिक क्लासेस अवधि । क्योंकि ncRNA में संक्रमण के दौरान इन प्रक्रियाओं के मौलिक जीवविज्ञान प्रक्रियाओं और विकार के लिए महत्वपूर्ण हैं, वे कर सकते हैं, इसलिए, चिकित्सकीय के लिए आकर्षक लक्ष्य बनाते हैं । इस पांडुलिपि पीढ़ी mRNA और गैर कोडिंग आरएनए अभिव्यक्ति पुस्तकालयों के लिए एक संशोधित प्रोटोकॉल, वायरल आरएनए सहित पूरे खून का एक नमूना से प्रदर्शित करता है । इस प्रोटोकॉल का अनुकूलन, बेहतर आरएनए शुद्धता, methylated RNAs की वसूली के लिए वृद्धि हुई बंधाव, और अधिक आरएनए प्रजातियों पर कब्जा करने की अनुमति देने के लिए आकार चयन छोड़ दिया ।
Introduction
अगली पीढ़ी के sequencing (NGS) जैविक जीवों के जीनोमिक स्तर पर होने वाले परिवर्तनों की जांच के लिए एक शक्तिशाली उपकरण के रूप में उभरा है । NGS तरीकों के लिए नमूना तैयारी जीव, ऊतक प्रकार, और अधिक महत्वपूर्ण बात यह शोधकर्ताओं को संबोधित करने के लिए उत्सुक हैं सवालों के आधार पर विविध किया जा सकता है । कई अध्ययनों से ऐसे स्वस्थ और बीमार व्यक्तियों के रूप में राज्यों के बीच जीन अभिव्यक्ति में मतभेदों का अध्ययन करने के एक साधन के रूप में NGS करने के लिए बदल गया है1,2,3,4। अनुक्रमण एक पूरे जीनोम के आधार पर जगह ले और एक शोधकर्ता सबसे अधिक कब्जा करने के लिए अनुमति देता है, नहीं तो सब, एक समय बिंदु पर एक विशेष आनुवंशिक मार्कर के लिए जीनोमिक जानकारी के ।
मनाया अभिव्यक्ति का सबसे आम मार्करों मैसेंजर RNAs (mRNAs) हैं । आरएनए-seq के लिए prepping पुस्तकालयों के लिए सबसे अधिक इस्तेमाल किया प्रक्रियाओं शुद्धिकरण, विखंडन, और ligations5,6की एक श्रृंखला के उपयोग के माध्यम से mRNA अणुओं की वसूली के लिए अनुकूलित कर रहे हैं । हालांकि, कैसे एक प्रोटोकॉल प्रदर्शन किया जा रहा है पर निर्णय नमूना प्रकार पर भारी निर्भर करता है और सवाल के बारे में पेश किया जा रहा नमूना कहा । अधिकांश मामलों में कुल आरएनए निकाला जाता है; फिर भी, नहीं सभी आरएनए अणुओं ब्याज की और ऐसे मामलों में mRNA अभिव्यक्ति अध्ययन पीढ़ी प्रचुर मात्रा में आरएनए प्रजातियों के रूप में, राइबोसोमल RNAs (rRNA) की तरह mRNAs के साथ जुड़े जासूसी टेप की संख्या में वृद्धि करने के लिए हटा दिया जाना चाहिए. प्रचुर मात्रा में rRNA अणुओं को हटाने के लिए सबसे लोकप्रिय और व्यापक रूप से इस्तेमाल विधि polyadenylated आरएनए की कमी है polyA घट7के रूप में निर्दिष्ट टेप । यह दृष्टिकोण mRNA अभिव्यक्ति के विश्लेषण के लिए अच्छी तरह से काम करता है क्योंकि यह mRNA टेप को प्रभावित नहीं करता है । हालांकि, पढ़ाई में जो नॉन कोडिंग या वायरल RNAs की दिलचस्पी है, polyA घट भी इन अणुओं को हटा देता है ।
कई अध्ययनों या तो mRNA अभिव्यक्ति (कोडिंग) या छोटे या बड़े गैर कोडिंग आरएनए के एक विशेष वर्ग की जांच करने के लिए आरएनए अनुक्रम पुस्तकालय तैयारी पर ध्यान केंद्रित करने के लिए चुनते हैं । हालांकि वहां हमारे जैसे अंय प्रक्रियाओं8 है कि दोहरी नमूना तैयारी के लिए अनुमति देते हैं, कई अध्ययनों से अलग अध्ययन के लिए अलग नमूनों से पुस्तकालयों तैयार जब उपलब्ध है । हमारे जैसे एक अध्ययन के लिए, यह आम तौर पर कई रक्त के नमूने समय, उपभोग्य, और पशुओं के तनाव में वृद्धि की आवश्यकता होगी । हमारे अध्ययन के लक्ष्य को जानवरों से पूरे रक्त का उपयोग करने के लिए पहचान करने के लिए और दोनों mRNA और गैर कोडिंग आरएनए के विभिन्न वर्गों स्वस्थ और अत्यधिक रोगजनक सुअर का प्रजनन और श्वसन सिंड्रोम वायरस (HP-PRRSV) के बीच व्यक्त करने में सक्षम होना था चुनौती9सूअरों,10 केवल एक ही पूरे रक्त का नमूना (प्रत्येक सुअर से २.५ मिलीलीटर) होने के बावजूद । आदेश में ऐसा करने के लिए, हम ठेठ निष्कर्षण और पुस्तकालय निर्माण प्रोटोकॉल का अनुकूलन करने के लिए उचित डेटा उत्पंन करने के लिए दोनों mRNA और गैर कोडिंग आरएनए (ncRNA) अभिव्यक्ति11 के विश्लेषण के लिए एक एकल नमूना से अनुमति देने की जरूरत है ।
यह एक प्रोटोकॉल है कि mRNA और गैर कोडिंग आरएनए विश्लेषण के लिए अनुमति दी के लिए एक की जरूरत है क्योंकि उपलब्ध मानक किट और आरएनए के लिए तरीके-निष्कर्षण और पुस्तकालय निर्माण mRNA के लिए मुख्य रूप से इरादा थे और एक पाली-एक कमी चरण12का उपयोग करें । इस कदम के नमूने से गैर कोडिंग आरएनए या वायरल टेप को ठीक करने के लिए यह असंभव बना दिया होता । इसलिए, एक अनुकूलित विधि की जरूरत थी कि नमूना polyA कमी के बिना कुल आरएनए निष्कर्षण के लिए अनुमति दी । इस पांडुलिपि में प्रस्तुत विधि एक नमूना प्रकार के रूप में पूरे रक्त के उपयोग के लिए अनुमति देने के लिए और दोनों mRNA और छोटे और बड़े आकार के ncRNAs के लिए अनुक्रमण पुस्तकालयों का निर्माण करने के लिए अनुकूलित किया गया है । विधि सभी detectable गैर के विश्लेषण के लिए अनुमति देने के लिए अनुकूलित किया गया है RNAs कोडिंग के रूप में के रूप में अच्छी तरह से बाद में जांच13के लिए वायरल RNAs बनाए रखने । सभी में, हमारे अनुकूलित पुस्तकालय तैयारी प्रोटोकॉल एक ही पूरे रक्त नमूना से कई आरएनए अणुओं की जांच के लिए अनुमति देता है ।
इस विधि के उपयोग के पीछे समग्र लक्ष्य एक प्रक्रिया है कि दोनों गैर कोडिंग आरएनए और पूरे रक्त का एक नमूना से mRNA के संग्रह के लिए अनुमति विकसित करने के लिए किया गया था । यह हमें mRNA, ncRNA, और हमारे अध्ययन में प्रत्येक जानवर के लिए वायरल आरएनए एक एकल नमूना9से स्रोत के लिए अनुमति देता है । यह, अंततः, अतिरिक्त पशु लागत के बिना अधिक वैज्ञानिक खोज के लिए अनुमति देता है और प्रत्येक व्यक्ति के नमूने की अभिव्यक्ति की एक और पूरी तस्वीर देता है । वर्णित विधि जीन अभिव्यक्ति के नियामकों की परीक्षा के लिए अनुमति देता है और साथ ही correlative दोनों mRNA और गैर कोडिंग आरएनए एक पूरे रक्त के नमूने का उपयोग कर अभिव्यक्ति की तुलना अध्ययन के पूरा होने की अनुमति के रूप में । हमारे अध्ययन इस प्रोटोकॉल का इस्तेमाल किया वायरल संक्रमित 9 सप्ताह पुराने पुरुष वाणिज्यिक सूअरों में जीन अभिव्यक्ति और संभव epigenetic नियामकों में परिवर्तन की जांच ।
Protocol
Representative Results
Discussion
प्रोटोकॉल में पहला महत्वपूर्ण कदम है कि यह बनाया अनुकूलित जोड़ा ग्लोबिन कमी कदम है, जो यह संभव गुणवत्ता प्राप्त करने के लिए पूरे रक्त के नमूनों से पढ़ता शामिल थे । sequencing अध्ययन में पूरे रक्त का उपयोग करन?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
यह काम मुख्य रूप से usda निफा आफरी 2013-67015-21236 द्वारा समर्थित था, और भाग में usda निफा आफरी 2015-67015-23216 द्वारा । इस अध्ययन के भाग में कृषि अनुसंधान सेवा अनुसंधान भागीदारी ओक रिज संस्थान द्वारा प्रशासित विज्ञान और शिक्षा (ORISE) के लिए अमेरिका के ऊर्जा विभाग के बीच एक समझौता समझौते के माध्यम से प्रबंध कार्यक्रम के लिए एक नियुक्ति द्वारा समर्थित किया गया था ( डो) और अमेरिका के कृषि विभाग । ORISE द्वारा प्रबंधित किया जाता है ओक रिज संबद्ध विश्वविद्यालयों के तहत डो अनुबंध सं. DE-AC05-06OR2310 ।
हम HP-PRRSV संक्रामक क्लोन के लिए dr. Kay Faaberg शुक्रिया अदा करना चाहूंगा, डॉ Susan Brockmeier प्रयोग में शामिल पशुओं के साथ उसकी मदद के लिए, और मुकदमा Ohlendorf पांडुलिपि की तैयारी में सचिवीय सहायता के लिए ।
Materials
| PAXgene Tubes | PreAnalytix | 762165 | |
| Molecular Biology Grade Water | ThermoFisher | 10977-015 | |
| mirVana miRNA Isolation Kit | ThermoFisher | AM1560 | |
| Rneasy MinElute Clean Up Kit | QIAGEN | 74204 | |
| 100% Ethanol | Decon Labs, Inc. | 2716 | |
| 0.2 mL thin-walled tubes | ThermoFisher | 98010540 | |
| 1.5 mL RNase/DNase – free tubes | Any supplier | ||
| Veriti 96-well Thermocycler | ThermoFisher | 4375786R | |
| Globin Reduction Oligo (α 1) | Any supplier | Sequence GAT CTC CGA GGC TCC AGC TTA ACG GT | |
| Globin Reduction Oligo (α 2) | Any supplier | Sequence TCA ACG ATC AGG AGG TCA GGG TGC AA | |
| Globin Reduction Oligo (β 1) | Any supplier | Sequence AGG GGA ACT TAG TGG TAC TTG TGG GT | |
| Globin Reduction Oligo (β 2) | Any supplier | Sequence GGT TCA GAG GAA AAA GGG CTC CTC CT | |
| 10X Oligo Hybridization Buffer | |||
| -Tris-HCl, pH 7.6 | Fisher Scientific | BP1757-100 | |
| -KCl | Millipore Sigma | 60142-100ML-F | |
| 10X RNase H Buffer | |||
| -Tris-HCl, pH 7.6 | Fisher Scientific | BP1757-100 | |
| -DTT | ThermoFisher | Y00147 | |
| -MgCl2 | Promega | A351B | |
| -Molecular Biology Grade Water | ThermoFisher | 10977-015 | |
| RNase H | ThermoFisher | AM2292 | |
| SUPERase-IN | ThermoFisher | AM2694 | Rnase inhibitor |
| EDTA | Millipore Sigma | E7889 | |
| Microcentrifuge | Any supplier | ||
| 2100 Electrophoresis BioAnalyzer Instrument | Agilent Technologies | G2938C | |
| Agilent RNA 6000 Nano Kit | Agilent Technologies | 5067-1511 | |
| Agilent High Sensitivity DNA Kit | Agilent Technologies | 5067-4626 | |
| TruSeq Stranded Total RNA Library Prep Kit with Ribo-Zero | Illumina | RS-122-2201 | mRNA kit; Human/Mouse/Rat Set A (48 samples, 12 indexes) |
| TruSeq Stranded Total RNA Sample Preparation Guide | Illumina | Available on-line | |
| RNAClean XP Beads | BeckmanCoulter | A63987 | |
| AMPure XP Beads | BeckmanCoulter | A63880 | |
| MicroAmp Optical 8-tube Strip | ThermoFisher | N8010580 | 0.2 ml thin-walled tubes |
| MicroAmp Optical 8-tube Strip Cap | ThermoFisher | N801-0535 | |
| RNase/DNase – free reagent reservoirs | Any supplier | ||
| SuperScript II Reverse Transcriptase | ThermoFisher | 18064-014 | |
| MicroAmp Optical 96 well plates | ThermoFisher | N8010560 | These were used in place of .3mL plates as needed |
| MicroAmp Optical adhesive film | ThermoFisher | 4311971 | |
| NEBNext Multiplex Small RNA Library Prep Set for Illumina® (Set 1) | New England Biolabs | E73005 | small RNA kit |
| NEBNext Multiplex Small RNA Library Prep Set for Illumina® (Set 2) | New England Biolabs | E75805 | small RNA kit |
| QIAQuick PCR Purification Kit | QIAGEN | 28104 | |
| 96S Super Magnet Plate | ALPAQUA | A001322 |
Riferimenti
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