Solo paso purificación de complejos macromoleculares utilizando RNA unido a biotina y un enlazador foto escindibles
Summary
Complejos de ARN/proteína purificados mediante estrategia de botín-estreptavidina se eluyen a solución bajo condiciones de desnaturalización en una forma inadecuada para la posterior purificación y análisis funcional. Aquí, describimos una modificación de esta estrategia que utiliza a un enlazador foto escindibles en RNA y un suave paso UV-elución, produciendo complejos de RNA/proteína nativas y completamente funcionales.
Abstract
Durante muchos años, la interacción excepcionalmente fuerte y rápidamente formada entre biotina y estreptavidina se ha utilizado con éxito para la purificación parcial de complejos RNA/proteína biológicamente importantes. Sin embargo, esta estrategia sufre una importante desventaja que limita su utilización más amplia: la interacción de la biotina/estreptavidina se puede romper solamente bajo desnaturalizar condiciones que también alteran la integridad de los complejos eluídas, de ahí que su Análisis funcional posterior y posterior purificación por otros métodos. Además, las muestras eluídas con frecuencia están contaminadas con las proteínas de fondo que un asocian con estreptavidina granos, que complica el análisis de los complejos purificados por plata y espectrometría de masas. Para superar estas limitaciones, hemos desarrollado una variante de la estrategia de biotina/estreptavidina biotina se une a un sustrato de RNA mediante un enlazador foto escindibles y los complejos inmovilizados en cuentas de estreptavidina se eluyen selectivamente a la solución en un forma nativa por onda larga UV, dejando las proteínas de fondo en las cuentas. Cortos sustratos de enlace de RNA pueden ser sintetizados químicamente con biotina y el vinculador foto escindibles covalentemente atado extremo 5′ del ARN, mientras que los dos grupos pueden proporcionar sustratos de RNA más largo por un oligonucleótido complementario. Estas dos variantes del método UV-elución fueron probadas para la purificación de los complejos de procesamiento de RNPnp dependiente U7 que cleave pre-mRNAs de las histonas en el extremo 3′ y ambos probaron a comparar favorablemente con otros previamente desarrollado métodos de purificación. Eluyen de UV de las muestras contuvieron cantidades fácilmente detectables de la RNPnp U7 que era libre de contaminantes de la proteína importante y conveniente para el análisis directo por espectrometría y análisis funcionales. El método descrito puede ser fácilmente adaptado para la purificación de otros complejos de unión de la RNA y utilizado conjuntamente con sitios de unión de ADN de hebra simple y doble para purificar DNA específico proteínas y complejos macromoleculares.
Introduction
En eucariotas, precursores de ARN polimerasa II genera ARNm (pre-mRNAs) se someten a varios eventos de maduración en el núcleo antes de ser completamente funcional plantillas de mRNA para la síntesis de proteínas en el citoplasma. Uno de estos eventos es el 3′ final de procesamiento. Para la mayoría de los pre-mRNAs, 3′ extremo proceso de elaboración es escote juntada a poliadenilación. Esta reacción de dos etapas es catalizada por un complejo relativamente abundante que consta de más de 15 proteínas1. Histona dependiente de replicación animal pre-mRNAs se procesan en el extremo 3′ por un mecanismo diferente en la que el papel es interpretado por U7 RNPnp, una abundancia baja compleja de U7 snRNA de ~ 60 nucleótidos y múltiples proteínas2,3 . El snRNA U7 de pares de bases con una secuencia específica de pre-mRNA de la histona y una de las subunidades de la U7 RNPnp cataliza la reacción de hendidura, generación madura histona mRNA sin un poly(A) cola. 3′ procesamiento del pre-mRNA de la histona también requiere lazo del vástago vinculante proteínas (SLBP), que se une un conservado-lazo del vástago situado aguas arriba del sitio de clivaje y aumenta la contratación de la RNPnp U7 al substrato2,3. Estudios destinados a identificar los componentes individuales de la U7 RNPnp han sido difíciles debido a la baja concentración de la RNPnp U7 en las células animales y la tendencia del complejo disociar o experimentan proteólisis parcial durante la purificación como resultado del uso detergentes suaves4,5,6, lavados de sal alta o múltiples pasos cromatográficos7,8,9.
Recientemente, para determinar la composición de la maquinaria de procesamiento de U7-dependiente, un fragmento corto de la biotina que contiene de pre-mRNA de histona 3′ o 5′ fue incubado con un extracto nuclear y los complejos armados fueron capturados en recubiertas de estreptavidina perlas de agarosa5,6,10. Debido a la interacción excepcionalmente fuerte entre biotina y estreptavidina, proteínas inmovilizadas en perlas de estreptavidina fueron eluidas bajo desnaturalizar condiciones hirviendo en SDS y analizadas por plata y espectrometría de masas. Mientras que este enfoque simple identifica un número de componentes de la U7 RNPnp, rindió muestras relativamente crudas, a menudo contaminadas con un gran número de proteínas de fondo un limitado a cuentas de estreptavidina, potencialmente enmascarar algunos de los componentes de la maquinaria de procesamiento y evitar su detección en la plata mancharon geles5,6,10. Lo importante, este enfoque también imposibilitó cualquier estudios funcionales con el material aislado y su posterior purificación a homogeneidad por otros métodos.
Se propusieron una serie de modificaciones con el tiempo para abordar la naturaleza prácticamente irreversible de la interacción de la biotina/estreptavidina, con la mayoría de ellos están diseñados para debilitar tanto la interacción o para proporcionar un brazo espaciador químicamente escindibles en la biotina-contener reactivos11,12. La desventaja de estas modificaciones fue que reducen significativamente la eficiencia del método o condiciones no fisiológicas a menudo requeridas durante la etapa de elución, poniendo en peligro la integridad o la actividad de las proteínas purificadas.
Aquí, describimos un enfoque diferente para resolver el problema inherente de la estrategia de biotina/estreptavidina utilizando RNA sustratos que biotina se une covalentemente a los 5′ extremo a través de una foto escindibles 1-(2 nitrofenil) molécula de etilo que es sensible a la onda larga UV13,14. Hemos probado este enfoque para la purificación de la maquinaria de procesamiento de U7-dependiente limitante de Drosophila y mamíferos nuclear extractos de15. Tras una breve incubación de biotina que contiene de pre-ARNm de histonas y el vinculador foto divisible con un extracto nuclear, los complejos de procesamiento montado son inmovilizados en perlas de estreptavidina, bien lavados y lanzó suavemente a la solución en un nativo se forman por la exposición a la luz de ~ 360 nm UV. El método de elución de la UV es muy eficiente, rápido y sencillo, produciendo una cantidad suficiente de la RNPnp U7 para visualizar sus componentes por astilla, manchas de tan poco como 100 μl del extracto de15. El material eluyó UV está libre de proteínas del fondo y adecuado para el análisis de espectrometría de masas en directo, pasos de purificación adicionales y ensayos enzimáticos. Se puede adoptar el mismo método para la purificación de otros complejos de RNA/proteína que requieren relativamente pocos sitios de unión de la RNA. Biotina y el vinculador foto escindibles pueden también covalente sujetarse a solo – y doble cadena ADN, potencialmente extender el método de elución de UV para la purificación de diversos complejos DNA/proteína.
Síntesis química de sustratos de RNA que contienen covalentemente había unido a biotina y el vinculador foto escindibles es práctico solamente con las secuencias que no superan los nucleótidos ~ 65, ser costoso e ineficiente para secuencias mucho más largas. Para solucionar este problema, también hemos desarrollado un enfoque alternativo que es conveniente para más objetivos vinculantes de RNA. En este enfoque, ARN de cualquier secuencia de la longitud y el nucleótido es generada en vitro por transcripción T7 o SP6 y recocido a un corto oligonucleótido complementario que contiene biotina y el vinculador foto escindibles en el extremo 5′ (trans configuración). Dúplex resultante posteriormente es utilizado para purificar proteínas individuales o complejos macromoleculares en granos de estreptavidina siguiendo el mismo protocolo descrito para los sustratos de RNA que contienen biotina foto escindibles unida covalentemente (cis configuración). Con esta modificación, la biotina foto escindibles puede utilizarse en conjunción con en vitro generadas las transcripciones que contienen cientos de nucleótidos, que se extiende el método de elución de UV para la purificación de una amplia gama de RNA/proteína.
Protocol
Representative Results
Discussion
El método descrito aquí es sencillo y además incorporando a un enlazador foto escindibles y el paso de rayos UV-elución no difiere de los métodos utilizados que se aprovechan de la fuerte interacción entre biotina y estreptavidina. El paso de rayos UV-elución es muy eficiente, liberando por lo general más del 75% de lo ARN inmovilizado y proteínas de granos de estreptavidina, dejando atrás un alto fondo de proteínas que se unen no específicamente a las cuentas asociadas. Mediante la eliminación de este fondo…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecemos a nuestros colegas y colaboradores por su contribución a nuestro trabajo. Este estudio fue apoyado por los NIH otorgan GM 29832.
Materials
| Streptavidin-Agarose | Sigma | S1638-5ML | |
| High-intensity, long-wave UV lamp | Cole-Parmer | UX-97600-00 | |
| Replacement bulb | Cole-Parmer | UX-97600-19 | 100 Watts Mercury H44GS-100M bulb emitting 366 nm UV light (Sylvania) |
| RNAs and oligonucleotides containing biotin and photo-cleavable linker in cis | Dharmacon (Lafayette, CO) or Integrated DNA Technologies, Inc. (Coralville, IA) | Requst a quote in Dharmacon | |
| Beckman GH 3.8 swing bucket rotor | Beckman | ||
| RiboMAX Large Scale RNA Production Systems (T7 polymerase) | Promega | P1300 | |
| RiboMAX Large Scale RNA Production Systems (SP6 polymerase) | Promega | P1280 | |
| Pierce Silver Stain Kit | ThermoFisher Scientific | 24612 |
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