Uso complementare di tecniche microscopiche e lettura di fluorescenza nello studio delle interazioni Cryptococcus-Amoeba
Summary
Questo documento descrive in dettaglio un protocollo per la preparazione di una co-cultura delle cellule criptococcali e delle amebe che viene studiata utilizzando immagini ancora fluorescenti e immagini al microscopio elettronico a trasmissione ad alta risoluzione. Di seguito sono illustrati in che modo i dati quantitativi possono integrare tali informazioni qualitative.
Abstract
Per simulare l’infezione da Cryptococcus, l’ameba, che è il predatore naturale delle cellule criptococcali nell’ambiente, può essere utilizzato come modello per i macrofagi. Questo organismo predatorio, simile ai macrofagi, utilizza la fagocitosi per uccidere le cellule interiorizzate. Con l’aiuto di un microscopio a scansione laser confocale, vengono catturate immagini che raffigurano momenti interattivi tra cellule criptococcali e ameba. La potenza di risoluzione del microscopio elettronico aiuta anche a rivelare il dettaglio ultrastrutturale delle cellule criptococcali quando intrappolate all’interno del vacuole alimentare ameba. Poiché la fagocitosi è un processo continuo, i dati quantitativi vengono quindi integrati nell’analisi per spiegare cosa accade nel momento in cui un’immagine viene acquisita. Per essere specifici, le unità di fluorescenza relativa vengono lette al fine di quantificare l’efficienza dell’ameba nell’internalizzare le cellule criptococcali. A questo scopo, le cellule criptococcali sono macchiate con un coloranti che le fa fluorescenza una volta intrappolate all’interno dell’ambiente acido del vacuole alimentare. Se usate insieme, le informazioni raccolte attraverso tali tecniche possono fornire informazioni critiche per aiutare a trarre conclusioni sul comportamento e sul destino delle cellule quando vengono interiorizzate da ameba e, eventualmente, da altre cellule fagocitiche.
Introduction
I microbi si sono evoluti nel tempo per occupare e prosperare in diverse nicchie ecologiche come i confini fisici aperti del suolo e dell’acqua, tra gli altri1. In queste nicchie, i microbi spesso si impegnano nella competizione diretta per risorse limitate; importante, per i nutrienti che usano per sostenere la loro crescita o lo spazio, che hanno bisogno di ospitare la popolazione in espansione2,3. In alcuni casi, alcuni organismi olozoici come l’ameba possono anche precedere le cellule criptococcali come un modo per estrarre sostanze nutritive dalla loro biomassa4,5. A sua volta, questo permette a tali organismi di stabilire il dominio territoriale attraverso il controllo del numero di popolazione della sua preda. A causa di questa pressione predatoria, alcune prede possono essere selezionate per produrre fattori microbici, come la capsula criptococcale6, per riconciliare gli effetti negativi della pressione. Tuttavia, come conseguenza involontaria di questa pressione, alcuni microbi acquisiscono fattori che permettono loro di attraversare la barriera delle specie e cercare nuove nicchie per colonizzare7, come gli spazi confinati del corpo umano che sono ricchi di sostanze nutritive e hanno l’ideale Condizioni. Quest’ultimo può spiegare come un microbo terrestre come Cryptococcus (C.) i neoforman possono trasformarsi per diventare patogeni.
A tal fine, è importante studiare il contatto iniziale che le cellule criptococcali possono avere con ameba e come questo può selezionarli per diventare patogeni. Più specificamente, Questo può dare indizi su come le cellule criptococcali si comportano quando agito su macrofagi durante l’infezione. È per questo motivo che l’ameba è stata scelta come modello per i macrofagi qui, in quanto è relativamente economico e facile mantenere una cultura dell’ameba in un laboratorio8. Di interesse era anche quello di esaminare come i metaboliti secondari criptococcali viz. 3-idrossici acidi grassi9,10 influenzano l’interazione tra amebe e cellule criptococcali.
Un modo semplice per percepire l’interazione tra ameba e la sua preda ad occhio nudo è quello di creare un prato utilizzando la sua preda sulla superficie di un piatto di agar e avvistare l’ameba. La visualizzazione di placche o zone chiare sulla piastra di agar raffigura aree in cui l’ameba può essersi nutrita della sua preda. Tuttavia, a questo macro livello, si nota solo l’esito del processo e il processo di fagocitosi è meccanizzato non può essere osservato. Pertanto, per apprezzare il processo da cellula a cellula, ci sono diversi metodi microscopici che possono essere utilizzati11,12. Ad esempio, un microscopio invertito con una camera di incubazione può essere utilizzato per registrare video di eventi tra una cellula fagocitica e il suo obiettivo13. Purtroppo, a causa del costo di un microscopio con una funzionalità time-lapse, non è sempre possibile per i laboratori acquistare un tale microscopio, soprattutto nelle impostazioni di scarso spazio.
Per aggirare la limitazione di cui sopra, questo studio presenta un disegno esplorativo sequenziale che valuta l’interazione di C. neoformans viz C. neoformans UOFS Y-1378 e C. neoformans LMPE 046 con Acanthamoeba castellani . In primo luogo, viene utilizzato un metodo qualitativo che precede un metodo quantitativo. Le immagini fisse vengono catturate utilizzando un microscopio a fluorescenza invertito, così come un microscopio elettronico di trasmissione per rappresentare le interazioni ameba-Cryptococcus. Questo è stato seguito dalla quantificazione della fluorescenza utilizzando un lettore di lamiere per stimare l’efficienza dell’ameba per internalizzare le cellule criptococcali. Quando si riconciliano i risultati di questi metodi durante la fase di interpretazione dei dati, ciò può rivelare anche tutte le informazioni critiche come l’utilizzo di un video time-lapse di fagocitosi.
Protocol
Representative Results
Discussion
Nel documento, diverse tecniche sono state impiegate con successo per rivelare il possibile risultato che può sorgere quando l’ameba interagisce con le cellule criptococcali. Inoltre, eravamo interessati a mostrare gli effetti degli acidi grassi 3-idrossici sul risultato delle interazioni Cryptococcus-amoeba.
La prima tecnica utilizzata è stata la microscopia confocale, che ha reso le immagini fisse. Il principale inconveniente di questa tecnica è stato che ci ha fornito solo infor…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Il lavoro è stato sostenuto da una sovvenzione della National Research Foundation of South Africa (numero di sovvenzione: UID 87903) e dell’Università dello Stato Libero. Siamo anche grati ai servizi e all’assistenza offerti da Pieter van Wyk e Hanlie Grobler durante i nostri studi di microscopia.
Materials
| 1,4-Diazabicyclo-[2.2.2]-octane | Sigma-Aldrich | D27802 | – |
| 1.5-mL plastic tube | Thermo Fisher Scientific | 69715 | – |
| 15-mL Centrifuge tube | Thermo Fisher Scientific | 7252018 | – |
| 50-mL Centrifuge tube | Thermo Fisher Scientific | 1132017 | – |
| 8-Well chamber slide | Thermo Fisher Scientific | 1109650 | – |
| Acetone | Merck | SAAR1022040LC | – |
| Amoeba strain | ATCCÒ | 30234TM | – |
| ATCC medium 712 | ATCCÒ | 712TM | Amoeba medium |
| Black 96-well microtiter plate | Thermo Fisher Scientific | 152089 | – |
| Centrifuge | Hermle | – | – |
| Chloroform | Sigma-Aldrich | C2432 | – |
| Confocal microscope | Nikon | Nikon TE 2000 | – |
| Epoxy resin: | |||
| [1] NSA | [1] ALS | [1] R1054 | – |
| [2] DER 736 | [2] ALS | [2] R1073 | – |
| [3] ERL Y221 resin | [3] ALS | [3] R1047R | – |
| [4] S1 (2-dimethylaminoethanol) | [4] ALS | [4] R1067 | – |
| Fluorescein isothiocyanate | Sigma-Aldrich | F4274 | – |
| Formic Acid | Sigma-Aldrich | 489441 | – |
| Fluoroskan Ascent FL | Thermo Fisher Scientific | 374-91038C | Microplate reader |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | – |
| Glutaraldehyde | ALS | R1009 | – |
| Hemocytometer | Boeco | – | – |
| Lead citrate | ALS | R1209 | – |
| Liquid Chromatography Mass Spectrometer | Thermo Fisher Scientific | – | |
| Methanol | Sigma-Aldrich | R 34,860 | – |
| Orbital shaker | Lasec | – | – |
| Osmium tetroxide | ALS | R1015 | – |
| pHrodo Green Zymosan A BioParticles | Life Technologies | P35365 | This is the pH-sensitive dye |
| Physiological buffer solution | Sigma-Aldrich | P4417-50TAB | – |
| Rotary shaker | Labcon | – | – |
| Sodium phosphate buffer: | |||
| [1] di-sodium hydrogen orthophosphate dihydrate | [1] Merck | [1] 106580 | – |
| [2] sodium di-hydrogen orthophosphate dihydrate | [2] Merck | [2] 106345 | |
| Transmission electron microscope | Philips | Philips EM 100 | – |
| Trypan blue | Sigma-Aldrich | T8154 | – |
| Ultramicrotome | Leica | EM UC7 | – |
| Uranyl acetate | ALS | R1260A | – |
| Vacuum dessicator | Lasec | – | – |
| Vial | Sigma-Aldrich | 29651-U | – |
| YNB | Lasec | 239210 | – |
| YPD agar | Sigma-Aldrich | Y-1500 | – |
Riferimenti
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