Formålet med denne protokol er at isolere epidermal keratinocytter fra rygskind fra voksne mus til en række downstream-applikationer såsom molekylær biologi, biokemi, fluorescens aktiveret celle sortering og primær in vitro-brug (f. eks. clonogen keratinocytter).
Den her beskrevne protokol er en pålidelig metode til høst af primære keratinocytter fra voksne hunmus (54 ± 2 dage gamle), hvilket giver ca. 30 x 106 levedygtige celler pr. mus. Primære voksne mus keratinocytter høstes fra rygskind af hunmus. Hanmus (~ 6 uger gamle) kan anvendes til keratinocyt høst afhængigt af kravene i forsøget. Euthanized mus er barberet og steriliseret med serielle skylninger i povidon jod og ethanol løsninger (70% alkohol). Efter desinfektion af musene fjernes rygskindet, og det subkutane fedt og musklen fjernes med en skalpel og kasseres. Skindet skæres i små stykker og behandles med en mild, lav temperatur trypsinization at løsne den nedre dermis fra epidermis. De afskårne epidermider omrøres ved lav hastighed, filtreres for at fjerne hårerne, tælles, og re-suspenderet i kulturmedium. Denne metode giver en fremragende enkelt cellesuspension af meget bestemmelse antal kimtal celler for mange downstream applikationer.
Pattedyrs hud dækker hele kroppen og tjener et væld af funktioner (f. eks. en primær fysisk barriere, temperaturregulering og fugt retention). I løbet af de sidste fem årtier, grundforskning på mus hud har givet nye oplysninger om strukturen og funktionen af huden. Musens hudmodel har i høj grad hjulpet forståelsen af den grundlæggende biologi bag de komplekse molekylære mekanismer af kemisk eller ultraviolet stråling-induceret carcinogenese. Disse muse hudmodeller leverede et betydeligt bidrag til forståelsen af menneskelige hudsygdomme og deres afbødning. For at udforske yderligere molekylære dissektion af de primære keratinocytter i hårsækken udviklingsmæssige biologi, stamcelleforskning, carcinogenese, og genetisk udforskning af epidermis, er det ofte ønskeligt at isolere og kultur primær epitelial keratinocytter fra mus hud til brug parallelt med in vivo eksperimenter. Den motiverende faktor i udviklingen af denne metode var behovet for en in vitro-analyse for clonogenic epidermal og hårsækken stamceller1,2. Der var også et presserende behov for enkelt celle suspensioner af Epidermal celler egnet til clonogenic assays3, fluorescens aktiveret celle sortering og flow flowcytometri3,4. Fordelene ved denne metode er en robust høst øge en størrelsesorden over andre metoder5,6, inddragelse af epitelial del af hårsækkene, og den høje culturability af de høstede celler. I 1980 ‘ erne var der ingen kendte metoder, der kunne opfylde disse krav. I de efterfølgende år blev denne metode raffineret for at øge celle udbyttet. Den vigtigste begrænsning af denne metode ville være maskering af nogle trypsin følsomme antistoffer, der ville kompromittere immunoreactivity6.
Musene fik husdyrhold i henhold til de specifikke patogenfrie retningslinjer. En til fem hunmus 54 ± 2 dages alderen blev opnået. I ældre mus, levedygtigheden af keratinocytter vil blive reduceret på grund af Anagen fase (vækst) af håret cyklus. Også, processen med trypsinization er vanskeligere i forhold til unge mus. Høst proceduren er blevet optimeret til den tyndere hud af hunmus sammenlignet med mandlige. Hanmus er generelt ikke anvendes til keratinocytproliferation høst, da de har en tendens til at kæmpe med hinanden under boliger og derfor kan efterlade ridser eller sår på huden.
Keratinocyt-høst metoden, der er beskrevet her, er udviklet til at producere høje udbytter af stærkt kulturable primære epidermal keratinocytter fra bagsiden af voksne hunmus. Disse keratinocytter er velegnede til flow cytometri, molekylær biologi applikation og primær cellekultur, herunder den clonogene analyse, der rapporteres her. Denne keratinocytproliferation høst metode har også været nyttigt for at studere andre downstream aspekter af kutan kemisk carcinogenese og tumor forfremmelse1,13.
Der er flere kritiske trin i protokollen. For det første blev der anvendt kvindelige mus i alderen 54 ± 2 dage til stringens og reproducerbarhed. Dette har gjort det muligt for os at udføre følsomme og kvantitative koloni assays fra flere stammer af mus og at bruge dem som en fænotype i sammenkædning analyse fører til identifikation af mindst én ny stamcelle regulerende gen10,11. For det andet, det er nyttigt at skære skind i mindre stykker, som trypsinization er mere effektiv end at forsøge at holde huden hele. For det tredje er tiden og temperaturen af trypsin flotation meget vigtig for den efterfølgende culturability. Desuden skal man “stikke betydeligt” på hårene tilbage på filteret for at opløse de vedlagte celler. Dette trin er vigtigt for at opnå høje udbytter af celler. Desuden er den 32 °C temperatur af inkubator vigtig for den langsigtede dyrkning af keratinocytter fra voksne mus. Endelig er de parallelle udlæsninger af in vitro-og in vivo-eksperimenter1 i denne protokol baseret på primære kulturer snarere end subkulturer eller cellelinjer. Især, hvis høst primære keratinocytter for første gang ved hjælp af denne protokol, holde de resterende dermis efter skrabning for at bekræfte den fulde fjernelse af hårsækkene sammen med epidermis ved histopatologiske observation.
Den vigtigste styrke af denne protokol for høst voksne mus keratinocytter er, at det producerer høje udbytter af bestemmelse antal kimtal celler, der er egnede til mange downstream applikationer. Den vigtigste begrænsning er, at nogle celleoverflade epitoper kan være følsomme over for trypsinisering, således at immun farvning kan være kompromitteret. Derfor, når du tester en ny celle overflade antistof, det kan være klogt at bruge en dispase6 eller thermolysin5 baseret metode til høst til sammenligning. Betydningen af denne protokol er, at den er blevet grundigt testet, kvantificeret og anvendt på så forskellige anvendelser som assays for de clonogene stamceller1,9,10,11, for masse kulturer i biokemi8, for FACS sortering i stamcelle analyse3,4, for molekylær biologi3,12, og for igangværende RNA og DNA sekventering.
The authors have nothing to disclose.
Forfatterne har ingen kvitteringer.
0.4% Trypan blue 1X in 0.9% saline | Life Technologies Gibco | 15250-061 | |
1 M HEPES Buffer | Sigma | H0887 | Sterile |
1.5-inch magnetic stir bar with pivot ring | Bel-Art, Wayne | 371101128 | in 2 oz Nalgene jar |
10 mL disposable pipettes | BD Falcon | 357551 | |
15 mL sterile conical tube | BD Falcon | 352097 | |
150 cm2 (T-150) culture flask | Corning | 430825 | |
2 mL Screw Cap Micro Tube Conical | Sarstedt | 72.608 | |
2 oz Nalgene jar | Thermo Fisher Scientific | 2118-0002 | 60 mL |
2.5% Trypsin solution 10X | Life Technologies Gibco | 15090-046 | |
225 cm2 (T-225) culture flask | Corning | 431082 | |
32 oz Nalgene Square Storage Bottles: PETG | Thermo Fisher Scientific | 2019-1000 | 1000 mL |
35-mm sterile culturing dish | Corning | 430165 | |
5 mL disposable pipets | BD Falcon | 357543 | |
50 mL sterile conicle tube | BD Falcon | 352098 | |
60-mm sterile culturing dish | Corning | 430166 | |
70% ethanol | |||
90-mm diameter Spectra Mesh filter, 74-µm pore size | Spectrum Laboratories | 145956 | |
Antibiotics (penicillin-streptomycin) | Life Technologies Gibco | 15140-122 | |
Bovine calf serum (BCS) | Thermo Fisher Scientific Hyclone | SH30073.03 | |
Bovine serum albumin | BD Biosciences | 354331 | |
CD34 Ram34 FITC conjugated antibody | BD Pharmingen | 553733 | |
CD49f (alpha6-integrin, GOH3) PE conjugated antibody | BD Pharmingen | 555736 | |
Cell Strainer, 70-µm sterile | BD Discovery Labware | 352350 | |
Collagen, Bovine, Type I, 30mg | BD Biosciences | 354231 | |
CoolCell Economical cell freezing container for 1 or 2 mL cryovials | Biocison | BCS-136PK | |
Corning 2mL Polypropylene Cryogenic Vial, Self-Standing with Round Bottom | Corning | 430659 | |
Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma | D2650 | |
Distilled Milli-Q water | made fresh; twice distilled reverse osmosis water | ||
Dulbecco’s phosphate-buffered saline 1X, Ca2+ and Mg2+ free | Life Technologies Gibco | 14190-144 | Sterile |
Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) | ATCC | 30-2002 | |
Fetal bovine serum (FBS) | Thermo Fisher Scientific Hyclone | SH 300070.03 | |
Fibronectin | Sigma | F1141-5MG | |
Fisherbrand 4 oz. Sterile Specimen Container | Fisher Scientific | 16-320-730 | |
Gentamicin 50 mg/mL 10 | Life Technologies Gibco | 15750-060 | |
KGM | Lonza | CC-3103 | |
Nalgene “Mr. Frosty" cell freezer | Thermo Fisher Scientific | 5100-0001 | |
Nalgene PC Straight-Side Wide-Mouth Jars, 16oz | Thermo Fisher Scientific | 2116-0500 | |
No. 22 sterile stainless-steel blades | BD Bard-Parker | 371222 | |
No. 4 scalpel handles | Biomedical Research Instruments | 26-1200 | In a cup with 70% ethanol |
One pair of full-curve eye dressing forceps | Militex | 18-784 | In a cup with 70% ethanol |
One pair of scissors | Biomedical Research Instruments | 25-1050 | In a cup with 70% ethanol |
One pair of thumb dressing forceps | Militex | 6-4 | In a cup with 70% ethanol |
Oster Pro-Cord/Cordless Trimmer no.40 blade | Jarden Consumer Solutions/Oster | 78997-010 | |
Plastic Petri dish 100 mm X 20 mm sterile | Corning | 430167 | |
Pyrex Brand Plain Stemless Glass Funnel | Corning | 6240-75 | |
Rat IgG2akappa FITC isotype control antibody | BD Pharmingen | 553929 | |
Rat IgG2akappa PE isotype control antibody | BD Pharmingen | 555844 | |
SFM | Life Technologies Gibco | 10725-018 | |
SMEM | Life Technologies Gibco | 11380-037 | |
SMEM: Ca2+ and Mg2+ free minimal essential medium for suspension culture | Life Technologies Gibco | 11380-037 | |
Square sterile plastic Petri dishes | BD Falcon | 351112 | |
Swiss mouse 3T3 fibroblasts | ATCC | CCL-92 | used within 10 passages |
Triadine; 10% Povidone-Iodine Prep Topical Solution, 16oz | Triad Group | 10-8216 | |
VWR Plastic Petri dishes, sterile Space Saver 100 X 10 | VWR | 25384-324 | |
Williams E Medium | Life Technologies Gibco | 12551-032 | |
Ziploc bag |