Ziel dieses Protokolls ist es, epidermale Keratinozyten aus der dorsalen Haut erwachsener Mäuse für eine Vielzahl nachgelagerter Anwendungen wie Molekularbiologie, Biochemie, Fluoreszenzaktivierte Zellsortierung und primäre In-vitro-Anwendungen (z. B. clonogene Keratinozyten).
Das hier beschriebene Protokoll ist eine zuverlässige Methode zur Ernte primärer Keratinozyten von erwachsenen weiblichen Mäusen (54 x 2 Tage alt), die etwa 30 x 106 lebensfähige Zellen pro Maus ergeben. Primäre erwachsene Maus Keratinozyten werden aus der rückenden Haut von weiblichen Mäusen geerntet. Männliche Mäuse (ca. 6 Wochen alt) können je nach den Anforderungen des Experiments zur Keratinozytenernte verwendet werden. Euthanisierte Mäuse werden mit seriellen Washes in Povidon-Jod- und Ethanollösungen (70% Alkohol) rasiert und sterilisiert. Nach der Desinfektion der Mäuse wird die Rückenhaut entfernt und das unterkutane Fett und der Muskel mit einem Skalpell entfernt und entsorgt. Die Häute werden in kleine Stücke geschnitten und mit einer leichten, niedertemperaturigen Trypsinisierung behandelt, um die untere Dermis von der Epidermis zu lösen. Die abgekratzten Epidermisen werden mit niedriger Geschwindigkeit gerührt, gefiltert, um die Haare zu entfernen, gezählt und im Kulturmedium wieder aufgehängt. Diese Methode bietet eine ausgezeichnete Einzelzellsuspension hochkultiierbarer Zellen für viele nachgeschaltete Anwendungen.
Säugetierhaut bedeckt den gesamten Körper und erfüllt eine Vielzahl von Funktionen (z. B. eine primäre physikalische Barriere, Temperaturregulierung und Feuchtigkeitsretention). In den letzten fünf Jahrzehnten hat die Grundlagenforschung zur Maushaut neue Informationen über die Struktur und Funktion der Haut gebracht. Das Maushautmodell hat sehr dazu beigetragen, die grundlegende Biologie hinter den komplexen molekularen Mechanismen der chemischen oder ultravioletten Strahlung-induzierten Karzinogenese zu verstehen. Diese Maushautmodelle leisteten einen wesentlichen Beitrag zum Verständnis menschlicher Hautkrankheiten und ihrer Abschwächung. Um die weitere molekulare Zerlegung der primären Keratinozyten in der Haarfollikelentwicklungsbiologie, Der Stammzellforschung, der Karzinogenese und der genetischen Erforschung der Epidermis zu untersuchen, ist es häufig wünschenswert, primäre Epithel zu isolieren und zu kulturieren. Keratinozyten aus der Mäusehaut parallel zu In-vivo-Experimenten zu verwenden. Der motivierende Faktor bei der Entwicklung dieser Methode war die Notwendigkeit eines In-vitro-Assays für clonogene epidermale und Haarfollikel-Stammzellen1,2. Es bestand auch ein dringender Bedarf an einzelzelligen Suspensionen von epidermalen Zellen, die für clonogene Assays3, fluoreszenzaktivierte Zellsortierung und Durchflusszytometrie3,4geeignet sind. Die Vorteile dieser Methode sind eine robuste Ernteerhöhung um eine Größenordnung gegenüber anderen Methoden5,6, Einbeziehung des Epithelanteils der Haarfollikel und die hohe Kultiumbarkeit der geernteten Zellen. In den 1980er Jahren gab es keine bekannten Methoden, die diese Anforderungen erfüllen konnten. In den folgenden Jahren wurde diese Methode verfeinert, um die Zellausbeute zu erhöhen. Die Hauptbeschränkung dieser Methode wäre die Maskierung einiger Trypsin-empfindlicher Antikörper, die die Immunreaktivität beeinträchtigen würden6.
Die Mäuse wurden nach den spezifischen pathogenfreien Richtlinien gemanak. Ein bis fünf weibliche Mäuse im Alter von 54 bis 2 Tagen wurden gewonnen. Bei älteren Mäusen wird die Lebensfähigkeit von Keratinozyten aufgrund der Anagenphase (Wachstum) des Haarzyklus reduziert. Auch der Prozess der Trypsinisierung ist schwieriger im Vergleich zu jungen Mäusen. Das Ernteverfahren wurde erfolgreich für die dünnere Haut weiblicher Mäuse im Vergleich zu männlichen Mäusen optimiert. Männliche Mäuse werden in der Regel nicht für Keratinozytenernten verwendet, da sie eine Tendenz haben, während des Gehäuses miteinander zu kämpfen und daher Kratzer oder Wunden auf der Haut hinterlassen können.
Die hier beschriebene Keratinozyten-Erntemethode wurde entwickelt, um hohe Erträge von hochkultivierbaren primären epidermalen Keratinozyten aus dem Rücken erwachsener weiblicher Mäuse zu produzieren. Diese Keratinozyten eignen sich für Diedurchflusszytometrie, molekularbiologische Anwendung und primäre Zellkultur, einschließlich des hier berichteten clonogenen Assays. Diese Keratinozyten-Erntemethode war auch nützlich für die Untersuchung anderer nachgelagerter Aspekte der kutanen chemischen Karzinogenese und Tumorförderung1,13.
Es gibt mehrere wichtige Schritte im Protokoll. Zunächst wurden für Strenge und Reproduzierbarkeit weibliche Mäuse im Alter von 54 bis 2 Tagen verwendet. Dies hat es uns ermöglicht, empfindliche und quantitative Kolonie-Assays von mehreren Stämmen von Mäusen durchzuführen und sie als Phänotyp in der Linkage-Analyse zu verwenden, was zur Identifizierung von mindestens einem neuen Stammzell-Regulierungsgen10,11führt. Zweitens ist es hilfreich, die Skins in kleinere Stücke zu schneiden, da die Trypsinisierung effektiver ist, als zu versuchen, die Haut ganz zu halten. Drittens ist die Zeit und Temperatur der Trypsinflotation sehr wichtig für die anschließende Kultivierung. Darüber hinaus muss man an den Aufstehenden der Haare , die auf dem Filter verbleiben, “erheblich poke”, um die angeschlossenen Zellen zu vertreiben. Dieser Schritt ist wichtig, um hohe Ausbeuten von Zellen zu erhalten. Darüber hinaus ist die 32 °C-Temperatur des Inkubators wichtig für den längerfristigen Anbau von Keratinozyten von erwachsenen Mäusen. Schließlich basieren in diesem Protokoll die parallelen Auslesungen von In-vitro- und In-vivo-Experimenten1 auf Primärkulturen und nicht auf Subkulturen oder Zelllinien. Insbesondere, wenn Ernte primäre Keratinozyten zum ersten Mal mit diesem Protokoll, halten Sie die verbleibende Dermis nach dem Abkratzen, um die vollständige Entfernung von Haarfollikel zusammen mit Epidermis durch histopathologische Beobachtung zu bestätigen.
Die Hauptstärke dieses Protokolls für die Ernte von erwachsenen Mauskeratinozyten besteht darin, dass es hohe Erträge an kulturierbaren Zellen produziert, die für viele nachgelagerte Anwendungen geeignet sind. Die Hauptbeschränkung ist, dass einige Zelloberflächenepitope empfindlich auf Trypsinisierung reagieren können, so dass die Immunfärbung beeinträchtigt werden kann. Daher kann es beim Testen eines neuen Zelloberflächenantikörpers sinnvoll sein, eine Dispase-6- oder Thermolysin-5-basierte Methode zum Vergleich zu verwenden. Die Bedeutung dieses Protokolls besteht darin, dass es streng getestet, quantifiziert und auf so unterschiedliche Anwendungen wie Assays für klonogene Stammzellen1,9,10,11, für Massenkulturen angewendet wurde. in der Biochemie8, zur FACS-Sortierung in der Stammzellanalyse3,4, für Molekularbiologie3,12, und für laufende RNA- und DNA-Sequenzierung.
The authors have nothing to disclose.
Die Autoren haben keine Anerkennung.
0.4% Trypan blue 1X in 0.9% saline | Life Technologies Gibco | 15250-061 | |
1 M HEPES Buffer | Sigma | H0887 | Sterile |
1.5-inch magnetic stir bar with pivot ring | Bel-Art, Wayne | 371101128 | in 2 oz Nalgene jar |
10 mL disposable pipettes | BD Falcon | 357551 | |
15 mL sterile conical tube | BD Falcon | 352097 | |
150 cm2 (T-150) culture flask | Corning | 430825 | |
2 mL Screw Cap Micro Tube Conical | Sarstedt | 72.608 | |
2 oz Nalgene jar | Thermo Fisher Scientific | 2118-0002 | 60 mL |
2.5% Trypsin solution 10X | Life Technologies Gibco | 15090-046 | |
225 cm2 (T-225) culture flask | Corning | 431082 | |
32 oz Nalgene Square Storage Bottles: PETG | Thermo Fisher Scientific | 2019-1000 | 1000 mL |
35-mm sterile culturing dish | Corning | 430165 | |
5 mL disposable pipets | BD Falcon | 357543 | |
50 mL sterile conicle tube | BD Falcon | 352098 | |
60-mm sterile culturing dish | Corning | 430166 | |
70% ethanol | |||
90-mm diameter Spectra Mesh filter, 74-µm pore size | Spectrum Laboratories | 145956 | |
Antibiotics (penicillin-streptomycin) | Life Technologies Gibco | 15140-122 | |
Bovine calf serum (BCS) | Thermo Fisher Scientific Hyclone | SH30073.03 | |
Bovine serum albumin | BD Biosciences | 354331 | |
CD34 Ram34 FITC conjugated antibody | BD Pharmingen | 553733 | |
CD49f (alpha6-integrin, GOH3) PE conjugated antibody | BD Pharmingen | 555736 | |
Cell Strainer, 70-µm sterile | BD Discovery Labware | 352350 | |
Collagen, Bovine, Type I, 30mg | BD Biosciences | 354231 | |
CoolCell Economical cell freezing container for 1 or 2 mL cryovials | Biocison | BCS-136PK | |
Corning 2mL Polypropylene Cryogenic Vial, Self-Standing with Round Bottom | Corning | 430659 | |
Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma | D2650 | |
Distilled Milli-Q water | made fresh; twice distilled reverse osmosis water | ||
Dulbecco’s phosphate-buffered saline 1X, Ca2+ and Mg2+ free | Life Technologies Gibco | 14190-144 | Sterile |
Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) | ATCC | 30-2002 | |
Fetal bovine serum (FBS) | Thermo Fisher Scientific Hyclone | SH 300070.03 | |
Fibronectin | Sigma | F1141-5MG | |
Fisherbrand 4 oz. Sterile Specimen Container | Fisher Scientific | 16-320-730 | |
Gentamicin 50 mg/mL 10 | Life Technologies Gibco | 15750-060 | |
KGM | Lonza | CC-3103 | |
Nalgene “Mr. Frosty" cell freezer | Thermo Fisher Scientific | 5100-0001 | |
Nalgene PC Straight-Side Wide-Mouth Jars, 16oz | Thermo Fisher Scientific | 2116-0500 | |
No. 22 sterile stainless-steel blades | BD Bard-Parker | 371222 | |
No. 4 scalpel handles | Biomedical Research Instruments | 26-1200 | In a cup with 70% ethanol |
One pair of full-curve eye dressing forceps | Militex | 18-784 | In a cup with 70% ethanol |
One pair of scissors | Biomedical Research Instruments | 25-1050 | In a cup with 70% ethanol |
One pair of thumb dressing forceps | Militex | 6-4 | In a cup with 70% ethanol |
Oster Pro-Cord/Cordless Trimmer no.40 blade | Jarden Consumer Solutions/Oster | 78997-010 | |
Plastic Petri dish 100 mm X 20 mm sterile | Corning | 430167 | |
Pyrex Brand Plain Stemless Glass Funnel | Corning | 6240-75 | |
Rat IgG2akappa FITC isotype control antibody | BD Pharmingen | 553929 | |
Rat IgG2akappa PE isotype control antibody | BD Pharmingen | 555844 | |
SFM | Life Technologies Gibco | 10725-018 | |
SMEM | Life Technologies Gibco | 11380-037 | |
SMEM: Ca2+ and Mg2+ free minimal essential medium for suspension culture | Life Technologies Gibco | 11380-037 | |
Square sterile plastic Petri dishes | BD Falcon | 351112 | |
Swiss mouse 3T3 fibroblasts | ATCC | CCL-92 | used within 10 passages |
Triadine; 10% Povidone-Iodine Prep Topical Solution, 16oz | Triad Group | 10-8216 | |
VWR Plastic Petri dishes, sterile Space Saver 100 X 10 | VWR | 25384-324 | |
Williams E Medium | Life Technologies Gibco | 12551-032 | |
Ziploc bag |