Un dosage de Transport rhodopsine par analyse de l’imagerie de haute teneur
Summary
Ici, nous avons décrit une méthode d’imagerie de haute teneur pour quantifier le transport des mutants de rhodopsine associée à une rétinite pigmentaire. Une analyse de notation d’onde multiples a été utilisée pour quantifier la protéine rhodopsin sur la surface de la cellule ou dans la cellule entière.
Abstract
Des mutations de rhodopsine pourrait conduisent à la mort de photorécepteur de tige qui se manifeste comme autosomique dominante rétinite pigmentaire (RP), un progressif aveuglante de maladie qui n’a pas de traitement efficace. Nous émettons l’hypothèse que la cytotoxicité du mutant rhodopsine mal repliées peut être atténuée en stabilisant pharmacologiquement la protéine mutante rhodopsine. La mutation de P23H, parmi les autres mutations de rhodopsine de classe II, code pour une protéine mutante rhodopsine structurellement instable qui s’accumule dans le réticulum endoplasmique (re), alors que la rhodopsine de type sauvage est transporté vers la membrane plasmique dans mammifères cellules. Précédemment, nous avons effectué un écran axée sur la luminescence de haut débit (HTS) et identifié un groupe de chaperons pharmacologiques qui a sauvé le transport de la rhodopsine P23H d’ER à la membrane plasmique. Ici, en utilisant une méthode d’immunomarquage suivie d’une analyse d’imagerie de haute teneur, nous avons mesuré la quantité de protéines mutantes rhodopsine dans la cellule entière et sur la membrane plasmique. Cette méthode est instructive et efficace pour identifier le vrais succès des faux positifs suite HTS En outre, l’analyse d’image haute teneur nous a permis de quantifier plusieurs paramètres d’une expérience unique pour évaluer les propriétés pharmacologiques de chaque composé. À l’aide de ce test, nous avons analysé l’effet de 11 différents composés vers six mutants de rhodopsine RP associé, obtention d’un profil pharmacologique 2D pour une compréhension quantitative et qualitative sur la stabilité structurelle de ces mutants rhodopsine et l’efficacité de différents composés vers ces mutants.
Introduction
Repliement est impliqué dans la dystrophie musculaire, dégénérescence neuronale, ainsi que des maladies aveuglantes, y compris une rétinite pigmentaire (RP)1. RP est une dégénérescence rétinienne héréditaire et progressive associée à des mutations dans plus de 60 gènes affectant la fonction et l’homéostasie des photorécepteurs de la tige ou les épithéliums pigmenté rétinien (RPE)2,3. Aucun traitement efficace n’est actuellement disponible pour RP. Les mutations de rhodopsine représentent environ 25-30 % d’autosomique dominante (ad) cas RP. Parmi les plus de 150 rhodopsine mutations4 (Human Gene Mutation Database, http:/ www.hgmd.cf.ac.uk/), les mutations de la classe II causent l’instabilité structurelle de la protéine de la rhodopsine qui contribue à la mort de photorécepteur de tige et vision perte5,6,7,8. Le P23H est la mutation de la rhodopsine plus fréquente en Amérique du Nord, qui est aussi un exemple typique de la classe II rhodopsine mutations9,10. En raison de son instabilité structurelle inhérente, la rhodopsine mal repliée s’accumule dans le réticulum endoplasmique (re) dans les cellules de mammifères, alors que la rhodopsine de type sauvage est situé sur la membrane plasmique5. La rhodopsine mal repliée P23H expositions mutant dominant négative cytotoxicité qui ne résulte pas de SIM1, mais est liée à l’activation d’ER associés voie de dégradation des protéines et l’organisation du segment externe tige interrompu. Pour atténuer le stress de cellules photoréceptrices tige, une stratégie consiste à stabiliser le pliage native de la rhodopsine mutant à l’aide d’un chaperon pharmacologique.
Pour atteindre cet objectif, nous avons réalisé un écran de haut débit basés sur les cellules (EMD)11,12,13 à l’aide d’une analyse de complémentation de fragment de β-galactosidase à quantifier le mutant de rhodopsine P23H transporté sur le plasma membrane. Le protocole simple et robuste de ce test HTS nous a permis d’explorer les activités d’environ 79 000 petites molécules pour chaque écran. Toutefois, parce que ce dosage HTS lit les signaux de luminescence, faux positifs, y compris les inhibiteurs de la β-gal, composés colorés ou cytotoxiques sont inclus dans la liste de résultats en attente d’être identifiés par une analyse secondaire.
L’immunomarquage traditionnel et méthodes d’imagerie de fluorescence ont été utilisés pour les années d’étudier le transport de la rhodopsine dans les cellules de mammifères5,14,15,16. Cependant, ces méthodes conventionnelles ne peuvent servir à quantifier les effets pharmacologiques des composés de plus de 10 vers le transport de la rhodopsine, parce qu’une analyse d’imagerie fiable requiert un grand nombre d’images prises dans des conditions très cohérente, qui est pas amendables par les méthodes d’imagerie conventionnelles. Ici, nous avons développé un protocole d’imagerie de haute teneur immunostaining basé comme test secondaire pour quantifier le transport de surface cellulaire de rhodopsine mal repliées mutants11,13,17. Pour étiqueter rhodopsine sur la membrane plasmique, nous avons sauté l’étape de la perméabilisation de la membrane cellulaire et immunomarquage des mutants de la rhodopsine par un anticorps monoclonal anti-rhodopsine de (B6-30) reconnaissant l’épitope N-terminale de la rhodopsine du côté extracellulaire de la cellule membrane18. Pour visualiser la rhodopsine mutant dans la cellule entière, nous fondue rhodopsine avec la protéine de fluorescence de Vénus. De quantifier les intensités de fluorescence dans les canaux de fluorescence différents, nous sommes en mesure d’obtenir plusieurs paramètres d’une expérience unique dont l’intensité totale rhodopsine dans la cellule entière, sur la surface de la cellule et le ratio de fluorescence de rhodopsine sur la surface de la cellule à celle de la cellule entière. En appliquant cette méthode pour stabiliser les cellules exprimant un total de six mutants rhodopsine mal repliées, nous pouvons générer un profil pharmacologique de plusieurs petites molécules chaperons vers ces mutants. Dans ce protocole, toutes les cellules sont immunocolorées dans une plaque 384 puits et photographié à l’aide d’un système automatisé d’imagerie sous condition d’imagerie très cohérent. Une analyse de l’image est effectuée pour chaque puits, contenant des images de plus de 600 cellules pour réduire la variation due à l’hétérogénéité des cellules avec des variables de niveau d’expression de forme et de la protéine cellulaire. Le flux de travail de ce protocole est résumée dans la Figure 1. L’avantage de cette méthode est que nous obtenons images haute résolution ainsi que multiparamétriques quantifications de l’analyse axée sur l’image. En général, le présent protocole peut être modifié et appliqué pour quantifier le transport d’une protéine de membrane mal repliées d’intérêt.
Protocol
Representative Results
Discussion
Ici, nous avons montré un test d’imagerie haute teneur utilisé pour caractériser les hits identifiés d’une HTS L’automatisation seule impliquée dans ces protocoles est l’imageur de haute teneur. L’immunomarquage et imagerie de fluorescence de la rhodopsine ont été utilisés couramment pour caractériser la localisation de la rhodopsine5,14,15,16. Cependant, la quantification de…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nous remercions le Dr Mark E. Schurdak et l’Université de Pittsburgh Drug Discovery Institute for fournissant l’imageur haute teneur et des formations initiales. Dr. Krzysztof Palczewski (Case Western Reserve University) a généreusement partagé le 4 1 et des anticorps anti-rhodopsine B630. Le plasmide contenant le cDNA de souris rhodopsin-Venus construire était partagé par m. Nevin Lambert (Université de Augusta). Ce travail a été soutenu par l’Institut National d’octroi de santé EY024992 YC et P30EY008098 de grant de l’Université de Pittsburgh Vision Research Core.
Materials
| U2OS (rhodopsin-Venus) cells | NA | NA | Stable cells generated from U2OS cells |
| U2OS (T4R-rhodopsin-Venus) cells | NA | NA | Stable cells generated from U2OS cells |
| U2OS (P23H-rhodopsin-Venus) cells | NA | NA | Stable cells generated from U2OS cells |
| U2OS (P53R-rhodopsin-Venus) cells | NA | NA | Stable cells generated from U2OS cells |
| U2OS (C110Y-rhodopsin-Venus) cells | NA | NA | Stable cells generated from U2OS cells |
| U2OS (D190N-rhodopsin-Venus) cells | NA | NA | Stable cells generated from U2OS cells |
| U2OS (P267L-rhodopsin-Venus) cells | NA | NA | Stable cells generated from U2OS cells |
| DMEM high glucose | Genesee Scientific | 25-500 | With L-Glutamine, sodium pyruvate |
| Fetal bovine serum (FBS) | Gibco | 16140071 | Heat inactivated |
| Plasmocin | InvivoGen | ant-mpt | Mycoplasma elimination reagent |
| Penicillin-Streptomycin (100X) | Gibco | 15140122 | 100X concentrated antibiotic solutions to prevent bacteria contamination of cell cultures |
| Trypsin-EDTA | Genesee Scientific | 25-510 | 0.25%, 1mM EDTA in HBSS without calcium and magnesium |
| Poly-L-lysine solution | Sigma-Aldrich | P4707-50ML | Mol wt 70,000-150,000, 0.01%, sterile-filtered, BioReagent, suitable for cell culture |
| CellCarrier-384 Ultra Microplates | PerkinElmer | 6057300 | 384-well tissue culutre-treated microplates with black well walls and an optically -clear cyclic olefin bottom for imaging cells in high content analysis |
| Sterile 96-well plate | Eppendorf | 30730119 | Tissue culture treated with lid flat bottom, sterile, free of detectable pyrogens, Rnase, DNase and DNA. Non-cytotoxic |
| Phosphate Buffered Sailine (PBS) | Invitrogen | AM9625 | 10 x PBS Buffer, pH 7.4 |
| DMSO | Sigma-Aldrich | D4540 | >99.5%, cell culture tested |
| 9-cis-retinal | Sigma-Aldrich | R5754 | |
| Compounds tested | Selleckchem/Life Chemicals/Custom synthesized | NA | Compounds were purchased from different vendors or custom synthesized |
| B6-30 anti-rhodopsin antibody | Novus | NBP2-25160 | Gift from Dr. Krzysztof Palczewski |
| Cy3-conjugated goat anti-mouse secondary antibody | Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc | 115-165-146 | |
| 16% paraformaldehyde | Thermo Fisher Scientific | 28908 | Methanol-free |
| 10% Normal Goat Serum | Thermo Fisher Scientific | 50062Z | Blocking buffer |
| Hoechst 33342, Trihydroch | Invitrogen | H3570 | Nuclear staining solution |
| High-content imager | Molecular Devices | ImageXpress | ImageXpress® Micro Confocal High-Content Imaging System |
| MetaXpress high-content image acquisition and analysis software | Molecular Devices | MetaXpress | High-content image acquisition and analysis software |
| Multichannel pipette (0.5-10 µL) | Rainin | 17013802 | Manual 8-channel pipette, 0.5-10 µL |
| Multichannel pipette (0.5-10c | Rainin | 17013805 | Manual 8-channel pipette, 20-200 µL |
| Electronic multichannel pipette (10-200 μL) | Thermo Scientific | 14-3879-56BT | Electronic multichanenel pipette for 96- and 384-well microplate pipetting tasks |
| 50ml Reagent Reservoir | Genesee Scientific | 28-125 | Reagent reservior for multichannel pippte dispensing |
| 8-Channel aspirator | ABC Scientific | EV503 | 8-Channel stainless steel adaptor for aspirating liquids from 96- or 384-well plates |
| Excel spreadsheet software | Microsoft | Excel2016 | The spreadsheet software for data analysis and heatmap generation |
| Origin2018 scientific data analysis and graphing software | OriginLab | Origin2018 | The data analysis software for generating the dose response curves |
Riferimenti
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