उच्च सामग्री इमेजिंग विश्लेषण द्वारा एक Rhodopsin परिवहन परख
Summary
यहां, हम रेटनाइटिस pigmentosa के साथ जुड़े rhodopsin म्यूटेंट के परिवहन को यों तो एक उच्च सामग्री इमेजिंग विधि वर्णित है । एक बहु-तरंग दैर्ध्य स्कोरिंग विश्लेषण सेल सतह पर या पूरे सेल में rhodopsin प्रोटीन यों तो इस्तेमाल किया गया था ।
Abstract
Rhodopsin खुलासा उत्परिवर्तनों रॉड photoreceptor मौत है कि autosomal प्रमुख रेटनाइटिस pigmentosa (आरपी), एक प्रगतिशील चकाचौंध रोग है कि प्रभावी उपचार की कमी के रूप में प्रकट होता है के लिए सीसा । हम परिकल्पना कि cytotoxicity rhodopsin उत्परिवर्ती का खुलासा औषधीय उत्परिवर्ती rhodopsin प्रोटीन स्थिर द्वारा समाप्त किया जा सकता है । P23H उत्परिवर्तन, अंय वर्ग द्वितीय rhodopsin उत्परिवर्तनों के बीच, एक संरचनात्मक अस्थिर rhodopsin उत्परिवर्ती प्रोटीन है कि endoplasmic जालिका (एर) में जमा है, जबकि जंगली प्रकार rhodopsin स्तनधारी में प्लाज्मा झिल्ली को ले जाया जाता है encodes कक्षों. हमने पहले एक luminescence आधारित उच्च प्रवाह स्क्रीन (HTS) का प्रदर्शन किया और औषधीय chaperones के एक समूह की पहचान की जो ईआर से प्लाज्मा झिल्ली तक P23H rhodopsin के परिवहन को बचाया । यहां, एक immunostaining एक उच्च सामग्री इमेजिंग विश्लेषण के बाद विधि का उपयोग कर, हम quantified उत्परिवर्ती rhodopsin प्रोटीन राशि पूरे सेल में और प्लाज्मा झिल्ली पर । इस विधि जानकारीपूर्ण और प्रभावी HTS निंनलिखित झूठी सकारात्मक से सच हिट की पहचान है । इसके अतिरिक्त, उच्च सामग्री छवि विश्लेषण के लिए हमें एक ही प्रयोग से एक से अधिक मापदंडों को बढ़ाता है प्रत्येक यौगिक के औषधीय गुणों का मूल्यांकन करने के लिए सक्षम होना चाहिए । इस परख का प्रयोग, हम छह आरपी संबद्ध rhodopsin म्यूटेंट की ओर 11 विभिंन यौगिकों के प्रभाव का विश्लेषण, इन rhodopsin म्यूटेंट की संरचनात्मक स्थिरता के बारे में एक मात्रात्मक और गुणात्मक समझ के लिए एक 2 डी औषधीय प्रोफ़ाइल प्राप्त करने और इन म्यूटेंट के प्रति विभिन्न यौगिकों की प्रभावकारिता.
Introduction
प्रोटीन खुलासा मांसपेशियों dystrophy में शामिल है, तंत्रिका अध…, साथ ही साथ अंधा कर रही बीमारियों, रेटनाइटिस pigmentosa (आरपी)1सहित । आरपी एक विरासत और प्रगतिशील रेटिना अध… समारोह और रॉड photoreceptors या रेटिना pigmented उपकला (RPEs)2,3के homeostasis को प्रभावित करने के ६० से अधिक जीन में उत्परिवर्तनों के साथ जुड़े है । कोई प्रभावी उपचार वर्तमान में आरपी के लिए उपलब्ध है । Rhodopsin उत्परिवर्तनों autosomal प्रमुख (विज्ञापन) आरपी मामलों के बारे में 25-30% के लिए खाते । अधिक से अधिक १५० rhodopsin उत्परिवर्तनों4 (मानव जीन उत्परिवर्तन डाटाबेस, http:/www. hgmd. cf. ac. यूके/), द्वितीय श्रेणी के उत्परिवर्तनों rhodopsin प्रोटीन है कि रॉड photoreceptor मौत के लिए योगदान के संरचनात्मक अस्थिरता का कारण है और दृष्टि हानि5,6,7,8। P23H उत्तरी अमेरिका में सबसे अधिक बार rhodopsin उत्परिवर्तन है, जो भी कक्षा द्वितीय rhodopsin उत्परिवर्तनों9,10का एक विशिष्ट उदाहरण है । अपने निहित संरचनात्मक अस्थिरता के कारण, rhodopsin स्तनधारी कोशिकाओं में endoplasmic जालिका (एर) में संचित है, जबकि जंगली प्रकार rhodopsin प्लाज्मा झिल्ली5पर स्थित है । । खुलासा rhodopsin P23H उत्परिवर्ती प्रमुख नकारात्मक cytotoxicity है कि haploinsufficiency के कारण नहीं है दर्शाती है, लेकिन एर जुड़े प्रोटीन क्षरण मार्ग और बाधित रॉड बाहरी खंड संगठन के सक्रियकरण से संबंधित है । रॉड photoreceptor सेल तनाव को कम करने के लिए, एक रणनीति के उत्परिवर्ती rhodopsin के देशी तह एक औषधीय निगरानी का उपयोग कर स्थिर है ।
इस लक्ष्य को प्राप्त करने के लिए, हम एक सेल आधारित उच्च प्रवाह स्क्रीन प्रदर्शन (HTSs)11,12,13 एक β-galactosidase टुकड़ा पूरक परख का उपयोग करने के लिए P23H rhodopsin उत्परिवर्ती प्लाज्मा पर उत्पात झिल्ली. इस HTS परख के मजबूत और सरल प्रोटोकॉल हमें प्रत्येक स्क्रीन के लिए के बारे में ७९,००० छोटे अणुओं की गतिविधियों का पता लगाने के लिए सक्षम होना चाहिए । हालांकि, क्योंकि इस HTS परख luminescence संकेतों पढ़ता है, β-लड़की अवरोधकों सहित झूठी सकारात्मक, रंग या साइटोटोक्सिक यौगिकों हिट सूची में शामिल है इंतज़ार कर एक माध्यमिक परख द्वारा की पहचान की है ।
पारंपरिक immunostaining और प्रतिदीप्ति इमेजिंग विधियों का उपयोग वर्षों से स्तनधारी कोशिकाओं में rhodopsin परिवहन का अध्ययन करने के लिए किया गया है5,14,15,16. हालांकि, इन पारंपरिक तरीकों को rhodopsin परिवहन की दिशा में 10 से अधिक यौगिकों के औषधीय प्रभाव यों तो इस्तेमाल नहीं किया जा सकता क्योंकि एक विश्वसनीय इमेजिंग विश्लेषण छवियों की एक बड़ी संख्या में एक अत्यधिक सुसंगत हालत है, जो है के तहत लिया की आवश्यकता है पारंपरिक इमेजिंग तरीकों से संशोधित नहीं । यहां, हम एक माध्यमिक परख के रूप में एक immunostaining आधारित उच्च सामग्री इमेजिंग प्रोटोकॉल विकसित करने के लिए rhodopsin म्यूटेंट11,13,17के सेल भूतल परिवहन को बढ़ाता है । प्लाज्मा झिल्ली पर rhodopsin लेबल करने के लिए, हम सेल झिल्ली permeabilization के कदम छोड़ दिया और immunostained rhodopsin म्यूटेंट द्वारा एक मोनोक्लोनल (बी-30) विरोधी rhodopsin पहचानने की एन-टर्मिनल epitope के rhodopsin पक्ष में सेल झिल्ली18. पूरे सेल में उत्परिवर्ती rhodopsin कल्पना करने के लिए, हम वीनस प्रतिदीप्ति प्रोटीन के साथ rhodopsin जुड़े । विभिन्न प्रतिदीप्ति चैनलों में प्रतिदीप्ति तीव्रता के ठहराव के द्वारा, हम एक एकल प्रयोग से एकाधिक पैरामीटर प्राप्त करने में सक्षम हैं पूरे सेल में कुल rhodopsin गहनता सहित, सेल की सतह पर, और के अनुपात rhodopsin प्रतिदीप्ति सेल सतह पर है कि पूरे सेल में । स्थिर कोशिकाओं छह rhodopsin म्यूटेंट की कुल व्यक्त करने के लिए इस पद्धति को लागू करने, हम इन म्यूटेंट के प्रति कई छोटे अणु chaperones की एक औषधीय प्रोफ़ाइल उत्पन्न कर सकते हैं. इस प्रोटोकॉल में, सभी कोशिकाओं को एक ३८४-अच्छी तरह से थाली में immunostained है और एक उच्च अनुरूप इमेजिंग हालत के तहत एक स्वचालित इमेजिंग प्रणाली का उपयोग कर imaged । एक छवि विश्लेषण एक अच्छी तरह से किया जाता है, अधिक से अधिक ६०० कोशिकाओं की छवियों युक्त कोशिका आकार और प्रोटीन अभिव्यक्ति स्तर बदलती के साथ कोशिकाओं के विविधता के कारण भिन्नता को कम करने के लिए. इस प्रोटोकॉल का वर्कफ़्लो चित्र 1में सारांशित है । इस विधि का लाभ यह है कि हम उच्च संकल्प छवियों के रूप में के रूप में अच्छी तरह से बहु-पैरामीटर quantifications छवि आधारित विश्लेषण से प्राप्त करते हैं । सामांय में, इस प्रोटोकॉल को संशोधित किया जा सकता है और ब्याज की किसी भी प्रगट झिल्ली प्रोटीन के परिवहन यों तो लागू होता है ।
Protocol
Representative Results
Discussion
यहां, हम एक उच्च सामग्री इमेजिंग निस्र्पक एक HTS से पहचान की हिट के लिए इस्तेमाल किया परख दिखाया । केवल स्वचालन इन प्रोटोकॉल में शामिल उच्च सामग्री imager है । rhodopsin के immunostaining और प्रतिदीप्ति इमेजिंग सामांयतः rhodopsi…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
हम उच्च सामग्री imager और प्रारंभिक प्रशिक्षण प्रदान करने के लिए डॉ मार्क ई. Schurdak और पिट्सबर्ग विश्वविद्यालय के ड्रग डिस्कवरी संस्थान का धंयवाद । Dr. Krzysztof Palczewski (मामले पश्चिमी रिजर्व विश्वविद्यालय) उदारता 1D4 और B630 विरोधी rhodopsin एंटीबॉडी साझा की है । माउस rhodopsin के सीडीएनए युक्त प्लाज्मिड-वीनस का निर्माण डॉ. Nevin Lambert (Augusta University) द्वारा साझा किया गया था. इस काम के राष्ट्रीय स्वास्थ्य अनुदान EY024992 के संस्थान से YC एंड P30EY008098 पिट्सबर्ग विजन रिसर्च कोर ग्रांट के विश्वविद्यालय द्वारा समर्थित किया गया था ।
Materials
| U2OS (rhodopsin-Venus) cells | NA | NA | Stable cells generated from U2OS cells |
| U2OS (T4R-rhodopsin-Venus) cells | NA | NA | Stable cells generated from U2OS cells |
| U2OS (P23H-rhodopsin-Venus) cells | NA | NA | Stable cells generated from U2OS cells |
| U2OS (P53R-rhodopsin-Venus) cells | NA | NA | Stable cells generated from U2OS cells |
| U2OS (C110Y-rhodopsin-Venus) cells | NA | NA | Stable cells generated from U2OS cells |
| U2OS (D190N-rhodopsin-Venus) cells | NA | NA | Stable cells generated from U2OS cells |
| U2OS (P267L-rhodopsin-Venus) cells | NA | NA | Stable cells generated from U2OS cells |
| DMEM high glucose | Genesee Scientific | 25-500 | With L-Glutamine, sodium pyruvate |
| Fetal bovine serum (FBS) | Gibco | 16140071 | Heat inactivated |
| Plasmocin | InvivoGen | ant-mpt | Mycoplasma elimination reagent |
| Penicillin-Streptomycin (100X) | Gibco | 15140122 | 100X concentrated antibiotic solutions to prevent bacteria contamination of cell cultures |
| Trypsin-EDTA | Genesee Scientific | 25-510 | 0.25%, 1mM EDTA in HBSS without calcium and magnesium |
| Poly-L-lysine solution | Sigma-Aldrich | P4707-50ML | Mol wt 70,000-150,000, 0.01%, sterile-filtered, BioReagent, suitable for cell culture |
| CellCarrier-384 Ultra Microplates | PerkinElmer | 6057300 | 384-well tissue culutre-treated microplates with black well walls and an optically -clear cyclic olefin bottom for imaging cells in high content analysis |
| Sterile 96-well plate | Eppendorf | 30730119 | Tissue culture treated with lid flat bottom, sterile, free of detectable pyrogens, Rnase, DNase and DNA. Non-cytotoxic |
| Phosphate Buffered Sailine (PBS) | Invitrogen | AM9625 | 10 x PBS Buffer, pH 7.4 |
| DMSO | Sigma-Aldrich | D4540 | >99.5%, cell culture tested |
| 9-cis-retinal | Sigma-Aldrich | R5754 | |
| Compounds tested | Selleckchem/Life Chemicals/Custom synthesized | NA | Compounds were purchased from different vendors or custom synthesized |
| B6-30 anti-rhodopsin antibody | Novus | NBP2-25160 | Gift from Dr. Krzysztof Palczewski |
| Cy3-conjugated goat anti-mouse secondary antibody | Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc | 115-165-146 | |
| 16% paraformaldehyde | Thermo Fisher Scientific | 28908 | Methanol-free |
| 10% Normal Goat Serum | Thermo Fisher Scientific | 50062Z | Blocking buffer |
| Hoechst 33342, Trihydroch | Invitrogen | H3570 | Nuclear staining solution |
| High-content imager | Molecular Devices | ImageXpress | ImageXpress® Micro Confocal High-Content Imaging System |
| MetaXpress high-content image acquisition and analysis software | Molecular Devices | MetaXpress | High-content image acquisition and analysis software |
| Multichannel pipette (0.5-10 µL) | Rainin | 17013802 | Manual 8-channel pipette, 0.5-10 µL |
| Multichannel pipette (0.5-10c | Rainin | 17013805 | Manual 8-channel pipette, 20-200 µL |
| Electronic multichannel pipette (10-200 μL) | Thermo Scientific | 14-3879-56BT | Electronic multichanenel pipette for 96- and 384-well microplate pipetting tasks |
| 50ml Reagent Reservoir | Genesee Scientific | 28-125 | Reagent reservior for multichannel pippte dispensing |
| 8-Channel aspirator | ABC Scientific | EV503 | 8-Channel stainless steel adaptor for aspirating liquids from 96- or 384-well plates |
| Excel spreadsheet software | Microsoft | Excel2016 | The spreadsheet software for data analysis and heatmap generation |
| Origin2018 scientific data analysis and graphing software | OriginLab | Origin2018 | The data analysis software for generating the dose response curves |
Riferimenti
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