백혈구 탈출구 Murine 피부 및 종양 림프 혈관을 통해 측정
Summary
여기, 우리는 순 진, 염증된에서 백혈구 탈출구의 정량화 vivo에서 악성 murine 피부에 대 한 방법을 보여 줍니다. 두 모델의 머리 비교를 수행 하는 우리: 경 피 FITC 응용과 현장에서 photoconversion. 또한, 피부 종양에서 백혈구 탈출구를 추적 하기 위한 photoconversion 유틸리티를 설명 합니다.
Abstract
고갈 림프절 주변 조직에서 백혈구 탈출구만 면역 감시 및 시작에 대 한 중요 하지 않습니다 하지만 또한 주변 조직 응답의 해상도에 기여. 다양 한 방법은 비 림프, 주변 조직에서 백혈구 탈출구를 계량 하는 데 사용 됩니다, 세포질이 고 분자 메커니즘을 맞는 탈출구를 제어 하는 불완전 하 게 이해 남아 있다. 여기, 우리는 murine 피부와 종양에서 백혈구 탈출구의 정량 분석에 대 한 현장에서 photoconversion 사용 하 여를 설명합니다. Photoconversion는 직접 라벨 백혈구의 피부 조직 내에서 거주 할 수 있습니다. 보라색 빛에 피부 노출 유도 로컬 하지만 선 동적인 응답 특징 백혈구 침투와 혈관 시키는 형광 추적기의 경 피 응용 프로그램 머리 비교에서 photoconversion 특히 철새 수지상 세포 인구를 분류 하 고 동시에 피부 microenvironments 및 종양에서 골수성과 림프 탈출구의 정량화를 사용. 백혈구 탈출구의 메커니즘 intratumoral 백혈구 복잡성에 대 한 우리의 이해에 누락 된 구성 요소를 유지 고 따라서 여기에 설명 된 도구 응용 프로그램 제공할 것 이다 종양의 역학에 대 한 독특한 통찰력 모두 면역 microenvironments 안정 된 상태와 치료에 대 한 응답에서
Introduction
주변 조직 면역 반응 염증의 사이트에 백혈구 신규 모집에 의해 뿐만 아니라 그들의 후속 보존 규제 메커니즘에 의해 형성 된다. 따라서, 보호 면역 체류 시간, 또는 오히려 림프 혈관을 통해 말 초 조직에서 마이그레이션합니다는 백혈구 입력 여부를 결정 하는 누적 세포 및 분자 메커니즘에 의해 결정 됩니다. 중요 한 것은, 백혈구 림프 혈관 (탈출구 되 나)을 통해 조직의 종료에 대 한 성향은 그들의 특수 기능에 연결 된다. 수지상 세포 (DC) 취득 성숙 신호 항 전송 및 배출 림프절 (dLN), 적응 면역1에 필요한 프로세스에서 프레 젠 테이 션에 대 한 응답에서 철새 행동. 청소 골수성 세포, 대 식 세포와 호 중구, 식 균 작용을 통해 apoptotic 파편을 취소를 제공 합니다. 세균 감염 시 호 중구 탈출구 조직 및 궁극적으로 apoptosis와 DSS 유도 colitis의 모델 dLNs2 에서 받게, 데이터 지원 macrophage 탈출구는 지역의 염증3를 해결 하는 데 필요한 가설. 그러나 Neutrophil 및 대 식 세포 출구 모든 염증 상황에서 발생 하는 여부, 불명 하다. 정상 상태4,5,,67,8감염된 및 염증된4,,910, 에서 T 림프 구 출구에 대 한 증거 11,12 주변, 비 림프 조직은 T 세포는 활발히 recirculate, 조직 기반 신호 운전이 출구를 제대로 이해 남아 있지만 나타냅니다. 여러 연구 결과 확인 21 (CCL21)와 그것의 수용 체 CCR74,11, chemokine (C C 모티브) 리간드를 포함 하 여 신호 배출 림프 모 세관 쪽으로 방향 마이그레이션에 필요한 후속 탈출구 13, 12 (CXCL12) chemokine (C X C 모티브) ligand 수용 체 CXCR42,14및 sphingosine 1 인산 염 (S1P)10,,1516. 그러나, 이러한 메커니즘은 모든 컨텍스트에서 활성 그리고 미결 문제에 남아 있다 여부 그들은 모든 종류의 세포 출구 결정. 중요 한 것은, 더 출구와 질병에서 기능적인 관련성을 제어 하는 메커니즘에 대 한 통찰력 필요 양적 vivo에서 분석의 방법을 합니다.
여러 가지 방법은 출구 여러 동물 모델에 vivo에 직접 cannulation 림프 혈관의 입양 전송 ex vivo 라는 백혈구, 형광 추적기의 경 피 응용 프로그램을 포함 하 여 계량 하는 데 사용 되었습니다. 레이블이 지정 된 입자, 그리고 photoconversion17,18 vivo에서 주입 구심 마우스 림프 혈관의 직접 cannulation 어렵고 작은 동물에서 수집 될 수 있는 액체의 양에 의해 제한 이다. 따라서, cannulation 크게 큰 동물에서 수행 되었습니다 (예., 양) 수술 조작 등은 실용적. 이러한 연구는 림프10,,1920에 림프 및 골수성 세포의 존재에 대 한 직접 증거를 제공합니다. 또한, 양 모델 공개는 급성 및 만성 염증 림프에 림프 구 존재 거의 10010,21증가.
중요 한 것은 분류 하 고 유전자 조작 세포의 입양 전송 공개 하 고 CCR7는 CD4의 탈출구 필요 심하게 염증이 피부5,11, 림프 톨의 전처리 하는 동안+ T 세포 작은 분자 S1P 수용 체 길 항 제, FTY720, 부분적 으로만 그들의 출구10를 억제. 흥미롭게도, 만성 염증이 피부에서 전송 된 림프 톨의 출구 CCR7 독립적인10, 이지만 부분적으로 CXCR49필요할 수 있습니다. 그러나 입양 전송 실험,, 제공 비 생리 적인 수 전 비보 의 활성화 및 레이블이 세포 주입, 조직 및 높은 중간 유체 압력의 biomechanical 환경 변경 통해 조직으로 그 초기 림프 모 세관 열고22그들의 전송 속성 변경 합니다. Fluorescein isothiocyanate (FITC) 피부 irritants의 유무에 한 대안, 경 피 응용 프로그램으로 (예., 틸 프 탈 레이트, DBP) 또는 감염23,24 의 추적에 대 한 수 추적 프로그램을 축적 하 고 dLNs를 마이그레이션할 phagocytic 세포. 마찬가지로, 붙일 레이블된 종양 종양 소재25잠겼습니다 있다 phagocytic 세포를 추적 하는 수단을 제공 합니다. 이러한 메서드는 DC 출구13,14,17,,2627 지배 하지만 비 phagocytic 추적할 수 있습니다 메커니즘에 대 한 중요 한 통찰력을 제공 림프 톨 그리고, 해석 성 FITC 따라서 철새, 라벨 LN 거주 Dc의 무료 림프 배수 하 여 복잡 한 수 있습니다.
또는, intravital 현미경 실시간으로,2829순수 관련 백혈구 인구의 비보에 추적을 허용 하는 강력한 도구입니다. 함께 사용 기자 마우스 및 생체 내에서 항 체 기반 immunofluorescent이 라벨, intravital 현미경 복잡 한 공간을 계시 했다 및 면역의 일시적인 역동성 셀 밀매, 포함 중간 마이그레이션30 , 림프 endothelium, 림프 루멘 및 마이그레이션 LN 항목28,31시 내 통로 환생. Intravital 이미징 기술의 광범위 한 채택 비용, 설정, 위해 필요한 전문 기술에 의해 제한 하 고 여러 세포 유형 측정 처리량 제한. 아직도, 인구 역학을 분석 하는 양적 방법 커플링 intravital 이미징 조직 것입니다 통찰력을 제공 추가 하 고 중요 한 기계 운동 성 및 마이그레이션 그리고 림프 모 세관 내에서 메커니즘에 관하여 18 , 31 , 32.
따라서, vivo에서 photoconversion 나왔다 제자리에 라벨, 허용 하는 방법으로 생리 적 백혈구 출구 (함께 사용할 경우 cytometry)의 정량화 및 phagocytic 활동의 독립은 부재 또는 도전의 존재입니다. 단풍나무-Tg 마우스 constitutively 후 레스터 변환 빨간색 형광 (빨강 단풍나무)33보라색 빛에 노출 될 때까지 녹색 형광 (가 그린)를 전시 하는 돌 산호에서 고립 된 단백질을 표현 한다. 그들은 주변 조직 사이트에서 탈출구로 Photoconverted 세포를 추적할 수 있습니다 dLNs에 축적. 이것 및 다른 유사한 photoconvertible 마우스 모델34,35 피부36에서 규정 하는 T 세포의 제정 탈출구, Peyer의 패치37에서에서 CXCR4 종속 B 세포 출구를 포함 하 여 중요 한 생물학을 계시 했다 , 펩 티 드 다시 도전38, 그리고 종양 microenvironments39에서 광범위 한 백혈구 송신 시 상주 메모리 T 세포의 동원. 여기, 우리는 피부 염증 및 photoconvertible 메서드를 사용 하면 기존 데이터의 직접적인 비교에 대 한 있도록 감염의 맥락에서 경 피 FITC 응용 프로그램 photoconversion의 머리 비교를 수행 합니다. 또한, 우리 이식된 종양에서 photoconversion를 설명 하 고 변환 효율 및 종양 microenvironments에서 선택적 탈출구를 기술 한다. 따라서, 우리는 더 이러한 방법의 응용 프로그램 필요 백혈구 출구 intratumoral 백혈구 복잡성, 항 종양 면역, 해석에 대 한 중요 한 영향을 미칠 것 이다, 종양에서의 중요 한 생물학을 명료 하 주장 하 고 치료에 응답입니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
주변, 비 림프 조직에서 백혈구 탈출구는 개시 및 면역 반응의 해결에 대 한 중요 한, 탈출구를 제어 하는 분자 메커니즘 이해 가난 하 게 된다. 지식에이 격차는 주로 정량화 비보에 대 한 도구의 준비 가용성 예정 이다. 여기, 우리 photoconvertible 마우스 (단풍나무-Tg) 피부와 종양에서 내 생 백혈구 탈출구를 계량 하 고 염증에 FITC 페인트로 직접 머리 비교를 제공 하 고 감염 모델의 사용을 설?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
저자 박사 마커 스 Bosenberg YUMM 1.1 및 YUMM 1.7 murine 흑색 라인 및 박사 데보라 J. Fowell b 6를 제공 하기 위한 제공 하는 것을 감사 하 고 싶습니다. RIKEN BRC 통해 국가 바이오-리소스 문 부 과학성, 일본의와 cg Tg(CAG-tdKaede) 15Utr 쥐.
Materials
| Collagenase D | Roche | 11088866001 | |
| DNase | Roche | 4536282001 | |
| Silver-LED-405B light source with optical fiber and collimtor | Prizmatix Ltd | V8144 | |
| Fluorescein isothiocyanate isomer I | Sigma-Aldrich | F4274 | |
| dibutyl phthalate | Sigma-Aldrich | 524980 | |
| acetone | Macron Fine Chemicals | 2440-02 | |
| 29-guage syringes | Exel International | 26029 | |
| Evans Blue | Sigma-Aldrich | E2129 | |
| 70 um cell strainers | VWR | 732-2758 | |
| paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | |
| HBSS | Caisson | HBL06 | |
| LIVE/DEAD Fixable Aqua Dead Cell Stain Kit | Invitrogen | L34966 | |
| Purified Anti-mouse CD16/CD32 | Tonbo Biosciences | 70-0161-M001 | |
| BV605 CD11c (clone N418) | Biolegend | 117334 | |
| PerCP-Cy5.5 MHCII (clone M5/114.15.2) | BD Pharmingen | 562363 | |
| BV421 CD3e (clone 145-2C11) | Biolegend | 100341 | |
| APC CD8a (clone 53-6.7) | TonBo Biosciences | 20-0081-u100 | |
| APC-Cy7 CD45 (clone 30-F11) | Biolegend | 103116 | |
| BV650 CD19 (clone 6D5) | Biolegend | 115541 | |
| PercCP-Cy5.5 Ly6C (clone HK1.4) | Biolegend | 128011 | |
| Alexa Fluor 647 F4/80 (clone BM8) | Biolegend | 123121 | |
| APC-Cy7 Ly6G (clone 1A8) | Biolegend | 127623 | |
| BV711 CD11b (clone M1/70) | Biolegend | 101241 | |
| BV605 CD45 (clone 30-F11) | Biolegend | 103155 | |
| BV711 CD4 (clone RM4-5) | BD Biosciences | 563726 | |
| Bovine serum albumin (Fraction V) | Fisher Scientific | BP1600-100 | |
| Anit-Rat and Anti-Hamster Igk / Negative Control Compensation Particle Set | BD Biosciences | 552845 | |
| Fortessa Flow Cytometer | BD Biosciences | ||
| FlowJo v10 Software | FlowJo |
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