دراسة إيمونوهيستوباثولوجيك الشخصية بلعم بيتا مستقبلات حمض الفوليك والأوعية الدموية المكروية محصنة في الخلية العملاقة الدموية
Summary
ويوضح البروتوكول استخدام فحص الأنسجة وإيمونوهيستوتشيميستري للشخصية بلعم بيتا مستقبلات حمض الفوليك وعلاقته بالخلايا المناعية مجموع التسلل في خزعات الشريان الزمانية في الخلية العملاقة الدموية.
Abstract
خلية عملاقة الدموية (الائتلاف) مرض مزمن المناعي بوساطة الشرايين متوسطة إلى كبيرة الحجم التي تؤثر على كبار السن. بيانات الائتلاف مع أعراض الانسداد من الصداع، التهاب المفاصل والسكتة الدماغية أو فقدان الرؤية. الضامة، والخلايا الليمفاوية T-مساعد اختراق جدار الأوعية الدموية وإنتاج استجابة برو تحريضية التي تؤدي إلى الضرر اللاحق بالسفينة والاسكيميه. وحتى الآن، هناك لا الائتلاف العلامات البيولوجية التي يمكن أن ترصد المرض النشاط ودليل الاستجابة العلاجية.
حمض الفوليك مستقبلات بيتا (FRB) هو بروتين جليكوسيلفوسفاتيديلينوسيتول التي ترتكز على أغشية الخلايا وعادة التعبير عنها في النسب حيدي وفي معظم خلايا سرطان الدم النقوي كذلك كما هو الحال في الأورام والمفاصل الضامة الزلالي، حيث يرتبط التعبير مع شدة المرض. قدرة FRB لربط مركبات حمض الفوليك، وحمض الفوليك-يصرف والمخدرات أنتيفولاتي جعلت هدفا دروجابل في مرض السرطان ومرض التهاب البحوث. ويصف هذا التقرير الأنسجة والمناعي الأساليب المستخدمة في تقييم التعبير وتوزيع FRB بالنسبة جكايمونوباثولوجي.
كانت ملطخة الشريان الزمانية الثابتة الفورمالين وجزءاً لا يتجزأ من البارافين خزعات من الائتلاف والضوابط العادية توضع وويوزين باستعراض علم الأنسجة: الأنسجة وتحديد ملامح أصم. إيمونوهيستوتشيميستري استخدمت للكشف عن التعبير FRB و CD68 و CD3. وأجرى تحليل المجهري لتحديد عدد الخلايا الملون إيجابيا على 10 أبواب عالية الطاقة-الحقل المحدد ومواقعها في الجدار الشرياني.
التهاب ليمفوهيستيوسيتيك (LH) مصحوبا بتضخم إينتيمال وتعطلت الصفيحة المرنة كان ينظر في الائتلاف مع أي الموجودة في عناصر التحكم. ارتشاح LH يتكون من 60% من الضامة اللمفاويات و 40 في المائة. التعبير FRB مقصور على الضامة، تتألف من 31 في المائة من مجموع بلعم السكان CD68 + والمترجمة لوسائط الإعلام، والغلالة. واعتبر لا FRB في عناصر التحكم.
هذا البروتوكول أظهرت نمطاً العددية والمكانية متميزة من بلعم FRB بالنسبة إلى المكروية مأمن الأوعية الدموية في الائتلاف.
Introduction
خلية عملاقة الدموية (الائتلاف) مرض التهاب الشرايين المتوسطة إلى الكبيرة، استهداف الشريان الاورطي وفروعه والتي تؤثر على كبار السن. ويقدم خفيفة إلى المضاعفات الدماغية حادة مثل الصداع، ألم الفك، وفقدان الرؤية، والسكتة الدماغية والأنسجة والغرغرينا. ويؤكد التشخيص علامات التهابات عالية مثل كرات الدم الحمراء معدل الترسيب (ESR) ونمط الأنسجة متميزة على الشريان الزمانية خزعة (علامة التبويب)1. الائتلاف الأوعية الكبار الأكثر شيوعاً، وإمكانية الوصول إلى الشريان الزمانية التي تم الحصول عليها للتشخيص ويعرض ميزة على غيرها فاسكولوباثيس، مما مكن واحد دراسة الآلية المرضية سهولة أكبر. وتشمل النتائج النموذجية في علامة التبويب التغلغل الضامة/النسيجية والخلايا اللمفية تي وجدت في كافة طبقات الأوعية الدموية الغلالة البطانية، ووسائط الإعلام، والغلالة مع تدمير المتزامنة الصفيحة المرنة التي عادة ما يفصل بين هذه 2من المقصورات. وتثبت الأدلة الحالية أن الائتلاف ينطوي مستضد غير معروف أنه ينشط الخلايا الجذعية في الغلالة الوعائية، متبوعاً بتوظيف مساعد خلايا T (Th)، على وجه التحديد Th1 و Th17 الأنواع الفرعية التي تفرز انترلوكين-17 و انترفيرون-غاما (IFG) على التوالي. IFG ثم المجندين وينشط الضامة لإنتاج السيتوكينات والبروتياز. وتشمل هذه السيتوكينات الموالية التحريضية؛ بما في ذلك إيل-12، الذي شكل متبادل ينشط خلايا Th1 وبالتالي توفير حلقة التغذية مرتدة إيجابية؛ عامل نخر الورم وانترلوكين-6، الذي يسبب التهاب المفاصل والحمى وميتالوبروتيسيس التي تلف الصفيحة المرنة. الكورتيزون (GC)، التي تشكل العلاج المزمن القياسية، التحكم جزئيا مسارات سيتوكين بتخفيف Th17/إيل-17 ولكن لا ذراع Th1/IFG3،الاستجابة المناعية4. ولسوء الحظ، يؤدي وقف GC انتكاس المرض. كطريقة بديلة، قد تم أغراض أخرى الميثوتريكسات لعلاج الائتلاف، ولكن النهاية السريرية المرجوة لم تتحقق دائماً على الرغم من أن لم تستخدم المؤشرات الحيوية أكثر حساسية للعلاج الرصد5،6 . في عام 2017، ومانع انترلوكين 6، توسيليزوماب، أقر للمعالجة للائتلاف كما أنه أظهر فعالية مكافحة الأمراض والستيرويد تجنيب الآثار7،8.
وحتى الآن، هناك لا المؤشرات الحيوية جيدة للائتلاف. كنتيجة لذلك، من الصعب رصد نشاط المرض وتيتراتي جرعات من الأدوية المتاحة تجنب الآثار الضارة وتخفيف عبء التكلفة للمجتمع. وبالتالي، من الضروري البحث عن العلامات البيولوجية مرشح أن يرتبط بنشاط المرض، وتقديم رؤى جديدة عن المرضية والمساعدة في اتخاذ القرارات العلاجية.
التقلبات بلعم التنشيط عامل حاسم في الائتلاف المرضية. وهكذا، قد يكون وسيلة فعالة لعلاج الائتلاف الاستهداف الانتقائي لتفعيل الضامة. بيتا مستقبلات حمض الفوليك (FRB) هو بروتين سكري جليكوسيل-فوسفاتيديلينوسيتول أن يرتكز على غشاء الخلية المعرب عنها في الخلايا العادية حيدي، خلايا سرطان الدم النقوي وتنشيط الضامة. أن يجند، حمض الفوليك، وهو فيتامين أساسي في شكله مخفضة، التي تمكن الخلوية التوليف ومثلايشن وإصلاح الحمض النووي9. هو فعل التعبير FRB في أمراض المناعة الذاتية وخلال التسرطن. التعبير عن المقيد لسطح وحيدات أو برو-التهابات الضامة M1 في التهاب المفاصل أو الالتهابات M2 الضامة في الجهاز الصلبة والأورام الخبيثة النقوي10،،من1112 , 13-بالإضافة إلى دورها المحتمل كالعلامات البيولوجية لتنشيط الضامة، يمكن تمكين FRB نقل المخدرات انتقائية من خلال عملية متعددة الخطوات تبدأ بربط مستقبلات حمض الفوليك أو أنتيفولاتيس أو المخدرات مترافق الفولات في الخلية السطح، تليها التدخيل والإفراج عنها وتسليم المخدرات المرجوة في نهاية المطاف إلى الخلية الداخلية إليه12،14،،من1516. وعلى نقيض FRB المعرب عنها في الخلايا السرطانية، وتنشيط الضامة، FRB التي أعرب عنها في الخلايا المكونة للدم العادي غير قادر على ربط فلتس مما يضمن أن تسليم المخدرات FRB/حمض الفوليك-بوساطة يقتصر على FRB المصابات بالتهاب أو الخلايا السرطانية.
وفي دراستنا السابقة، أثبتنا للمرة الأولى أن يتم التعبير عن FRB في الائتلاف الضامة والتعبير يرتبط مع CD68 + و endothelin مستقبلات بيتا الضامة، التي تسهم في الائتلاف المرضية17. في هذا التقرير، يصف لنا نسيجية والمناعي الأساليب المستخدمة في تقييم بلعم FRB، وحلل اللمفاويات مجموع وبلعم التهم إلى التبصر في الموقف FRB على الساحة الأوعية الدموية الائتلاف.
Protocol
Representative Results
Discussion
الائتلاف هو التهاب الأوعية الأكثر شيوعاً في البالغين، ولها سمة مرضية تجسد مجموعة قوية من لمفاوية مساعد تي وتنشيط الضامة التي ترد أيضا في سائر الأمراض الحبيبية أو فاسكولوباثيس مثل ساركويد و 2،بوليانجييتيس الحبيبي3. في الائتلاف، يوفر الشريان الزماني تمثيل ج…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وأمكن هذا العمل بالدعم من الدكتور دوغلاس السلالم، ماريان كلينغر، بينكو Ann، شعبة أمراض الروماتيزم/قسم الطب والجزيئية و “الأنسجة الأساسية المختبرية”، و “بنسلفانيا الدولة كلية الطب في جامعة”، هيرشي بنسلفانيا
Materials
| Microtome | Reichert-Jung | ||
| plain and frosted microscope slides and cover slips | Fisher Scientific | ||
| Vertical rack | Fisher Scientific | ||
| Light microscope | Olympus BX60 microscope | ||
| Xylene | |||
| Acetone in distilled water | concentrations 100%, 90%, 70% | ||
| Tris-buffered saline solution (TBS) | Dako Wash BufferS3006 | ||
| 3% hydrogen peroxide in TBS | |||
| Diaminobenzidine (DAB) | Sigma Fast Tablet set | ||
| Chemical Permount Mounting Medium | Fisher Scientific | SP-15-100 | |
| Harleco Gill's III Hematoxylin | Fiisher Scientific 23-750-019 | ||
| Harleco Eosin Y 1% Alcoholic Stock Solution | Fisher Scientific | 23-749-977 | |
| 10 mM citric acid monohydrate (pH 6.0) | |||
| Polyclonal rabbit anti-folate receptor beta | Manohar Ratnam | optimized at 1:800 | |
| Monoclonal mouse anti-human CD68 | Dako | M071801 | optimized at 1:200 |
| Polyclonal rabbit anti-CD3 | Agilent Dako | A0452 | optimized at 1:100 |
| Polymer goat anti- rabbit/mouse secondary antibody | Dako | ||
| Placental tissue | for FRB positive control |
Riferimenti
- Klippel, J. H., Stone, J. H., White, P. H. . Primer on the rheumatic diseases. , (2008).
- Weyand, C. M., Goronzy, J. J. Immune mechanisms in medium and large-vessel vasculitis. Nature Reviews Rheumatol. 9 (12), 731-740 (2013).
- Weyand, C. M., Liao, Y. J., Goronzy, J. J. The immunopathology of giant cell arteritis: diagnostic and therapeutic implications. Journal of Neuro-ophthalmology. 32 (3), 259-265 (2012).
- Deng, J., Younge, B., Olshen, R., Goronzy, J., Weyand, C. Th17 and Th1 T-cell responses in giant cell arteritis. Circulation. 121, 906-915 (2010).
- Mahr, A. D., et al. Adjunctive methotrexate for treatment of giant cell arteritis: an individual patient data meta-analysis. Arthritis & Rheumatology. 56 (8), 2789-2797 (2007).
- Hoffman, G. S., et al. A multicenter, randomized, double-blind, placebo-controlled trial of adjuvant methotrexate treatment for giant cell arteritis. Arthritis & Rheumatology. 46 (5), 1309-1318 (2002).
- Stone, J. H., Klearman, M., Collinson, N. Trial of Tocilizumab in Giant-Cell Arteritis. New England Journal of Medicine. 377 (15), 1494-1495 (2017).
- Milman, N. Tocilizumab increased sustained glucocorticoid-free remission from giant cell arteritis. Annals of Internal Medicine. 167 (12), JC63 (2017).
- Xia, W., et al. A functional folate receptor is induced during macrophage activation and can be used to target drugs to activated macrophages. Blood. 113 (2), 438-446 (2009).
- Shen, J., et al. Folate receptor-beta constitutes a marker for human proinflammatory monocytes. Journal of Leukocyte Biology. 96 (4), 563-570 (2014).
- Salazar, M. D., Ratnam, M. The folate receptor: what does it promise in tissue-targeted therapeutics. Cancer and Metastasis Reviews. 26 (1), 141-152 (2007).
- Low, P. S., Henne, W. A., Doorneweerd, D. D. Discovery and development of folic-acid-based receptor targeting for imaging and therapy of cancer and inflammatory diseases. Accounts of Chemical Research. 41 (1), 120-129 (2008).
- Puig-Kroger, A., et al. Folate receptor beta is expressed by tumor-associated macrophages and constitutes a marker for M2 anti-inflammatory/regulatory macrophages. Ricerca sul cancro. 69 (24), 9395-9403 (2009).
- Nakashima-Matsushita, N., et al. Selective expression of folate receptor beta and its possible role in methotrexate transport in synovial macrophages from patients with rheumatoid arthritis. Arthritis & Rheumatology. 42 (8), 1609-1616 (1999).
- vander Heijden, J. W., et al. Folate receptor beta as a potential delivery route for novel folate antagonists to macrophages in the synovial tissue of rheumatoid arthritis patients. Arthritis & Rheumatology. 60 (1), 12-21 (2009).
- Jansen, G., Peters, G. J. Novel insights in folate receptors and transporters: implications for disease and treatment of immune diseases and cancer. Pteridines. 26 (2), 41-53 (2015).
- Albano-Aluquin, S., Malysz, J., Aluquin, V. R., Ratnam, M., Olsen, N. An immunohistochemical analysis of folate receptor beta expression and distribution in giant cell arteritis – a pilot study. American Journal of Clinical and Experimental Immunology. 6 (6), 107-114 (2017).
- Ross, J. F., Chaudhuri, P. K., Ratnam, M. Differential regulation of folate receptor isoforms in normal and malignant tissues in vivo and in established cell lines. Physiologic and clinical implications. Cancer. 73 (9), 2432-2443 (1994).
- Reiner, N. E. Methods in molecular biology. Macrophages and dendritic cells. Methods and protocols. Preface. Methods in Molecular Biology. 531, (2009).
- Robertson, D., Savage, K., Reis-Filho, J. S., Isacke, C. M. Multiple immunofluorescence labelling of formalin-fixed paraffin-embedded (FFPE) tissue. BMC Cell Biology. 9, 13 (2008).
- Pawlina, W. . Histology: A text and atlas with correlated cell and molecular biology. , (2016).
- Kumar, V., Abbas, A., Robbins Aster, J. . Robbins and Cotran pathologic basis of disease. , (2015).
- Dabbs, D. J. . Diagnostic immunohistochemistry. , (2019).
- Ross, J. F., et al. Folate receptor type beta is a neutrophilic lineage marker and is differentially expressed in myeloid leukemia. Cancer. 85 (2), 348-357 (1999).
- Holzapfel, G. A., Fratzl, P. Collagen in arterial walls: biomechanical aspects. Collagen. Structure and Mechanics. , 285-324 (2008).
- Sultan, H., Smith, S. V., Lee, A. G., Chevez-Barrios, P. Pathologic Markers Determining Prognosis in Patients with Treated or Healing Giant Cell Arteritis. American Journal of Ophthalmology. , (2018).
