Une étude Immunohistopathologic pour profiler le Folate récepteurs bêta Macrophage et vasculaire microenvironnement immunitaire dans l’artérite à cellules géantes
Summary
Le protocole illustre l’utilisation de l’examen histopathologique et immunohistochimie à profil macrophage folate récepteurs bêta et sa relation avec la cellule immunitaire totale s’infiltrent dans les biopsies de l’artère temporale dans l’artérite à cellules géantes.
Abstract
Artérite à cellules géantes (GCA) est une chronique auto-immune maladie des artères de tailles moyenne à grande qui affecte les personnes âgées. GCA manifestes souffrant d’arthrite et symptômes occlusifs de maux de tête, accident vasculaire cérébral ou de perte de vision. Les macrophages et les lymphocytes T-helper s’infiltrer dans la paroi vasculaire et produisent une réponse pro-inflammatoire qui mènent à une lésion vasculaire et une ischémie. A ce jour, il n’y a aucun biomarqueur de GCA qui peut surveiller la maladie activité et guide de réponse thérapeutique.
Acide folique récepteurs bêta (FRB) est une protéine glycosylphosphatidylinositol ancrée sur les membranes cellulaires et normalement exprimée dans la lignée de myélomonocytaire et dans la majorité des cellules de leucémie myéloïde, ainsi que dans la tumeur et les macrophages synoviaux rhumatoïdes, où son expression est corrélée avec la sévérité de la maladie. La capacité de la FRB pour lier des composés de l’acide folique, acide folique-conjugués et médicaments antifoliques a fait une cible thérapeutiques dans le cancer et la recherche sur les maladies inflammatoires. Ce rapport décrit les méthodes histopathologiques et immunohistochemical utilisés pour évaluer l’expression et la distribution de FRB en ce qui concerne les GCAimmunopathology.
Biopsies de l’artère temporale fixés au formol et inclus en paraffine de GCA et témoins normaux ont été colorées à l’hématoxyline et éosine revue histologie du tissu et identifier les fonctionnalités pathognomoniques. L’immunohistochimie a été utilisé pour détecter l’expression FRB, CD68 et CD3. Une analyse microscopique a été réalisée afin de quantifier le nombre de cellules colorées positivement sur les 10 sections de high-power-champ sélectionnées et leurs emplacements respectifs dans la paroi artérielle.
L’inflammation des Lymphohistiocytes (LH) accompagné de l’hyperplasie intimale et limitante élastique perturbé chez GCA avec aucun trouvé chez les témoins. L’infiltrat LH se composait d’environ 60 % de lymphocytes et 40 % de macrophages. L’expression FRB était restreinte aux macrophages, composée de 31 % de la population totale de macrophage CD68 + et localisée à la média et l’adventice. Aucun FRB a été observée chez les témoins.
Ce protocole a démontré une nette tendance numérique et spatiale du macrophage FRB par rapport au micro-environnement immunitaire vasculaire de GCA.
Introduction
Artérite à cellules géantes (GCA) est une maladie inflammatoire des artères moyennes à grandes, ciblant l’aorte et ses branches et qui touchent les personnes âgées. Il présente avec légère à des complications ischémiques sévères tels que maux de tête, douleur à la mâchoire, une perte de vision, accidents vasculaires cérébraux et les tissus de la gangrène. Le diagnostic est confirmé par les marqueurs de l’inflammation élevées comme la vitesse de sédimentation globulaire (VSG) et un modèle histopathologique distinct sur l’artère temporale biopsie (onglet)1. GCA est la vascularite adulte plus commun, et l’accessibilité de l’artère temporale obtenu pour le diagnostic présente un avantage sur les autres vasculopathies, ce qui permet à on d’étudier sa pathogenèse plus facilement. Les résultats typiques dans onglet incluent un infiltrat des macrophages/histiocytes et des lymphocytes T dans toutes les couches vasculaires de l’intima de tunica, média et adventice avec destruction simultanée de la lame élastique qui sépare normalement ces compartiments2. L’évidence actuelle démontre que GCA implique un antigène inconnu qui active les cellules dendritiques dans l’adventitia vasculaire, suivi par le recrutement d’assistant des cellules T (Th), spécifiquement les sous-types Th1 et Th17 qui sécrètent l’interleukine-17 et l’interféron-gamma (IFG) respectivement. IFG puis recrute et active les macrophages pour produire des cytokines et des protéases. Il s’agit de cytokines pro-inflammatoires ; notamment IL-12, qui réciproquement active les cellules Th1 offrant ainsi une boucle de rétroaction positive ; facteur de nécrose tumorale et l’interleukine-6, qui provoquent l’arthrite et les fièvres et les métalloprotéases qui endommagent la lame élastique. Glucocorticoïdes (GC), qui constituent la norme de traitement chronique, contrôlent partiellement les voies des cytokines en atténuant la Th17/IL-17 mais pas le bras Th1/IFG de la réponse immunitaire3,4. Malheureusement, abandon du GC se traduit par la rechute de la maladie. Comme une modalité alternative, le méthotrexate a été réaffecté pour le traitement de la GCA, mais les critères d’évaluation cliniques désirés n’étaient pas toujours atteint bien que biomarqueurs plus sensibles n’ont pas été utilisés pour la surveillance thérapeutique5,6 . En 2017, l’inhibiteur de l’interleukine 6, tocilizumab, a été approuvé pour le traitement de GCA, comme l’a démontré efficacement contre la maladie et stéroïde épargnant les effets7,8.
A ce jour, il n’y a aucune bonnes biomarqueurs de GCA. En conséquence, il est difficile de surveiller l’activité de la maladie et titrer les doses de médicaments disponibles afin d’éviter les effets indésirables et de réduire le fardeau du coût pour la société. Ainsi, il est impératif de chercher un biomarqueur candidat qu’est en corrélation avec l’activité de la maladie, éclairerait roman sur la pathogenèse et l’aide aux décisions thérapeutiques.
Le dérèglement de l’activation des macrophages est un facteur critique dans la pathogenèse de la GCA. Ainsi, un moyen efficace de traiter la GCA peut-être le ciblage sélectif des macrophages activés. L’acide folique récepteurs bêta (FRB) est une glycoprotéine glycosyl-phosphatidylinositol qui est ancrée sur la membrane cellulaire exprimée dans les cellules normales myélomonocytaire, cellules de leucémie myéloïde et activé macrophages. Son ligand, l’acide folique est une vitamine essentielle dans sa forme réduite, ce qui permet à l’ADN cellulaire synthèse, méthylation et réparation9. L’expression FRB est induite dans les maladies auto-immunes et au cours de la cancérogenèse. Son expression est limitée à la surface des monocytes ou macrophages pro-inflammatoires de M1 dans la polyarthrite rhumatoïde, ou aux anti-inflammatoires M2 macrophages dans les organes pleins et myéloïde10,11,12 , 13. en plus de son rôle potentiel comme biomarqueur des macrophages activés, la FRB pouvez activer le transport de drogue sélective à travers un processus en plusieurs étapes qui commence par la fixation du récepteur de l’acide folique, antifolates ou médicaments folate conjugué à la cellule surface, suivie d’intériorisation, de libération et de livraison éventuelle de drogue souhaitée à la cellule interne machines12,14,15,16. Contrairement aux FRB exprimée dans les cellules cancéreuses et activé macrophages, FRB exprimée dans les cellules hématopoïétiques normales ne peut lier les folates assurant que FRB/folate-mediated medicaments se limite à FRB séropositifs inflammatoire ou de cellules cancéreuses.
Dans notre étude précédente, nous avons démontré pour la première fois que FRB s’exprime dans les macrophages de GCA et son expression corrélée avec CD68 + et l’endothéline macrophages de récepteurs bêta, qui contribuent à la GCA pathogenèse17. Dans ce rapport, nous décrivons la histopathologiques et méthodes immunohistochimiques pour évaluer le macrophage FRB et analysé le total de lymphocytes et macrophages compte pour avoir un aperçu de la position de la FRB dans le paysage vasculaire de GCA.
Protocol
Representative Results
Discussion
GCA est la vascularite plus courante chez les adultes, et sa caractéristique pathologique illustre une combinaison puissante des lymphocytes de T helper et activé macrophages que l’on retrouve également dans d’autres maladies granulomateuses ou vasculopathies comme la sarcoïdose et Polyangéite granulomateuse2,3. En GCA, l’artère temporale fournit une bonne représentation d’une artère de taille moyenne à grande, et la biopsie TA donne un échantillo…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ce travail a été rendu possible grâce au soutien du Dr. Douglas Stairs, Marianne Klinger, Ann Benko, la Division de rhumatologie du département de médecine et le moléculaire et histopathologique Core laboratoire, Penn State University College of Medicine, Hershey ‘ s PA.
Materials
| Microtome | Reichert-Jung | ||
| plain and frosted microscope slides and cover slips | Fisher Scientific | ||
| Vertical rack | Fisher Scientific | ||
| Light microscope | Olympus BX60 microscope | ||
| Xylene | |||
| Acetone in distilled water | concentrations 100%, 90%, 70% | ||
| Tris-buffered saline solution (TBS) | Dako Wash BufferS3006 | ||
| 3% hydrogen peroxide in TBS | |||
| Diaminobenzidine (DAB) | Sigma Fast Tablet set | ||
| Chemical Permount Mounting Medium | Fisher Scientific | SP-15-100 | |
| Harleco Gill's III Hematoxylin | Fiisher Scientific 23-750-019 | ||
| Harleco Eosin Y 1% Alcoholic Stock Solution | Fisher Scientific | 23-749-977 | |
| 10 mM citric acid monohydrate (pH 6.0) | |||
| Polyclonal rabbit anti-folate receptor beta | Manohar Ratnam | optimized at 1:800 | |
| Monoclonal mouse anti-human CD68 | Dako | M071801 | optimized at 1:200 |
| Polyclonal rabbit anti-CD3 | Agilent Dako | A0452 | optimized at 1:100 |
| Polymer goat anti- rabbit/mouse secondary antibody | Dako | ||
| Placental tissue | for FRB positive control |
Riferimenti
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