Folate 수용 체 베타 대 식 세포와 거 대 세포 동맥에서 혈관 면역 Microenvironment를 프로 파일링 하는 Immunohistopathologic 연구
Summary
프로토콜은 조직 검사 및 immunohistochemistry folate 수용 체 베타 macrophage와 총 면역 세포와의 관계는 거 대 세포 동맥 생 검 측 두 엽 동맥에에서 침투 하는 프로 파일의 사용을 보여 줍니다.
Abstract
거 대 세포 동맥 (GCA) 만성 면역 중재 매체-큰 크기의 동맥의 영향을 미치는 질병 노인 이다. GCA 매니페스트 관절염과 두통의 폐색 증상, 뇌졸중 또는 손실 비전. 대 식 세포 및 T-헬퍼 세포 혈관 벽에 침투 하 고 선박 손상 및 허 혈 이어질 프로 염증 반응을 생산. 날짜 하려면, 아무 GCA 바이오 마커 질병 활동 및 가이드 치료 응답을 감시할 수 있는 있다.
Folate 수용 체 베타 (FRB)는 glycosylphosphatidylinositol 단백질을 세포 막에 정박 하 고 일반적으로 myelomonocytic 혈통 및 또한 종양 및 류 마티스 활 액 세포, 골수성 백혈병 세포의 대부분을 표현 어디의 식을 질병의 심각도와 상관 한다. FRB의 능력 화합물 엽 산, 엽 산-어원이 같은 말 및 antifolate 마약을 했다 druggable 대상을 암 및 염증 성 질환 연구. 이 보고서 식 및 GCAimmunopathology에 관하여 FRB의 배포를 평가 하는 데 사용 하는 조직 및 immunohistochemical 방법을 설명 합니다.
GCA 및 일반 컨트롤에서 포 르 말린 고정 파라핀 포함 및 측 두 엽 동맥 biopsies Hematoxylin 및 오신 조직 조직학을 검토 하 여 pathognomonic 기능 스테인드 했다. Immunohistochemistry는 FRB, CD68 CD3 식 감지 하 사용 되었다. 현미경 분석 척도 10 선택 된 고 전력 필드 섹션 및 동맥 벽에 그들의 각각 위치에 긍정적으로 얼룩진된 셀의 수를 수행 했다.
Lymphohistiocytic (LH) 염증 내 증식 동반 및 방해 탄력 있는 lamina 컨트롤에 없음 GCA에 보였다. LH 침투는 약 60% 40%와 세포 대 식 세포의 구성 되었다. FRB 식 세포, CD68 + macrophage 총인구의 31%를 구성 하 고 미디어와 adventitia로 제한 했다. 아니 FRB 컨트롤에서 보였다.
이 프로토콜 GCA에 혈관 면역 microenvironment 기준으로 FRB macrophage의 고유한 숫자 및 공간 패턴을 보여주었다.
Introduction
거 대 세포 동맥 (GCA)의 매체-큰 동맥, 대동맥 및 그것의 분 지를 대상으로 하 고 노인에 영향을 미치는 염증 성 질환 이다. 그것은 온화한 두통, 턱 통증, 시력 손상, 뇌졸중과 조직 괴 저 등 심각한 허 혈 성 합병증을 선물 한다. 진단은은 적혈구 침 강 속도 (ESR)와 측 두 엽 동맥 생 검 (탭)1에 별개 조직 패턴 같은 높은 염증 성 마커에 의해 확인 된다. GCA는 가장 일반적인 성인 맥 고 진단에 대 한 얻은 측 두 엽 동맥의 내게 필요한 옵션 하나 더 쉽게 그것의 병 인 연구를 활성화 하는 다른 vasculopathies에 비해 우위를 선물 한다. 탭에 일반적인 연구 결과 세포/histiocytes 및 일반적으로이 구분 하는 탄력 있는 lamina의 동시 파괴 tunica intima, 미디어, 그리고 adventitia의 모든 혈관 층에 걸쳐 발견 하는 T 세포의 침투를 포함 구획2. 도우미의 채용 다음 T (Th) 세포, 특히 Th1과 Th17 하위 인터 루 킨-17 분 비는, 현재 증거 보여줍니다 GCA 혈관 adventitia에 수지상 세포를 활성화 하는 알 수 없는 항을 포함 하 고 인터페론-감마 (IFG) 각각. IFG 다음 신병 고 cytokines 및 프로 테아 제를 생산 하는 세포를 활성화 합니다. 이러한 프로 염증 성 cytokines; 포함 IL-12, 상호 긍정적인 피드백 루프; 제공 Th1 세포 활성화를 포함 하 여 종양 괴 사 인자와 인터 루 킨-6, 관절염과 열과 metalloproteases는 원인이 손상 탄력 있는 lamina. 스테로이드 제제 (GC), 표준 만성 치료를 구성 하는 부분적으로 약하게 Th17/IL-17 하지만 면역 반응3,4의 Th1/IFG 팔 하지 여 cytokine 경로 제어 합니다. 불행히도, GC의 중지 질병 재발 발생합니다. 대체 양식 적임으로 토트 GCA 치료 용도가 변경 하지만 더 민감한 생체 치료 모니터링5,6에 대 한 활용 하지는 않지만 원하는 임상 끝점 일관 되 게 달성 하지 했다 . 2017 년, 인터 류 킨 6 차단기, tocilizumab, 같이 그것은 효과적으로 질병 관리 및 스테로이드 효과7,8살려주는 GCA의 치료를 위해 승인 되었다.
날짜 하려면, GCA에 대 한 더 좋은 생체 있다. 결과적으로, 그것은 질병 활동을 모니터링 하 고 부작용을 방지 하 고 사회 비용의 부담을 줄이기 위해 사용할 수 있는 약물의 복용량을 적정 어렵다. 따라서, 질병 활동 상호 병 인 및 치료 결정에 있는 원조에 새로운 통찰력을 제공 하는 후보 biomarker에 대 한 보고는 것이 필수적 이다.
대 식 세포 활성화의 dysregulation GCA 병 인에 중요 한 요소 이다. 따라서, GCA 치료의 효과적인 수단 활성화 된 대 식 세포의 선택적 대상 수 있습니다. Folate 수용 체 베타 (FRB)는 세포 막에 정박 glycosyl phosphatidylinositol 당단백질 정상적인 myelomonocytic 셀, 골수성 백혈병 세포에에서 표현 하 고 대 식 세포를 활성화. 그것의 ligand, 엽 산, 세포질 DNA 합성, 메 틸 화 및 수리9수 감소 형태로 필수적인 비타민 이다. 자가 면역 질환 및 발암 중 FRB 식이 유도 된다. 그 식이 고체 기관 및 골수성 악성10,,1112 monocytes 또는 류 마티스 관절염, 프로-염증 성 M1 세포의 표면에 또는 항 염증 제 M2 세포에 제한 , 13. 활성화 된 대 식 세포의 biomarker로 그것의 잠재적인 역할, FRB는 엽 산, antifolates 또는 셀에서 folate 활용 약물 수용 체 바인딩으로 시작 하는 다단계 프로세스를 통해 선택적 약물 전송 가능 표면, 국제화, 릴리스 및 내부 셀 기계12,14,,1516원하는 약물의 최종 배달 합니다. 대조적으로 FRB 암 세포에 표현 하 고 대 식 세포 활성화, 정상 조 혈 세포에 표현 하는 FRB는 FRB/엽 산 중재 약물 전달 FRB 양성 염증 성 또는 암 세포가 되도록 folates 바인딩할 수.
우리의 이전 연구에서 우리는 FRB GCA 대 식 세포에 표현 되는 처음으로 시연 하 고 표현 연관 CD68 + 및 endothelin 수용 체 베타 세포, GCA pathogenesis17을. 이 보고서에서 우리는 histopathological 설명 및 immunohistochemical 방법 FRB macrophage를 평가 하는 데 사용 총 림프 구 분석 그리고 macrophage GCA 혈관에 FRB의 위치에 대 한 통찰력을 얻기 위해 계산.
Protocol
Representative Results
Discussion
GCA는 성인에서 가장 흔한 맥 그리고 그것의 pathologic 특징 T 조 수 세포의 강력한 조합을 보여준다 또한 다른 granulomatous 질병 또는 sarcoidosis 같은 vasculopathies에서 찾을 수 있는 대 식 세포를 활성화 하 고 granulomatous polyangiitis2,3. GCA, 측 두 엽 동맥 매체-큰 크기의 동맥의 좋은 표시를 제공 합니다 및 조교 생 저장 될 수 있는 파라핀 블록에 년, 따라서 진단 신…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 작품 박사 더글러스 계단, 마리 안 Klinger, 앤 Benko, 사단의 류 마티스/학과 의학 그리고 분자 조직 핵심 연구소, 펜 주립 대학 대학의과 대학, 허쉬 실바의 지원에 의해 가능 하 게 되었다
Materials
| Microtome | Reichert-Jung | ||
| plain and frosted microscope slides and cover slips | Fisher Scientific | ||
| Vertical rack | Fisher Scientific | ||
| Light microscope | Olympus BX60 microscope | ||
| Xylene | |||
| Acetone in distilled water | concentrations 100%, 90%, 70% | ||
| Tris-buffered saline solution (TBS) | Dako Wash BufferS3006 | ||
| 3% hydrogen peroxide in TBS | |||
| Diaminobenzidine (DAB) | Sigma Fast Tablet set | ||
| Chemical Permount Mounting Medium | Fisher Scientific | SP-15-100 | |
| Harleco Gill's III Hematoxylin | Fiisher Scientific 23-750-019 | ||
| Harleco Eosin Y 1% Alcoholic Stock Solution | Fisher Scientific | 23-749-977 | |
| 10 mM citric acid monohydrate (pH 6.0) | |||
| Polyclonal rabbit anti-folate receptor beta | Manohar Ratnam | optimized at 1:800 | |
| Monoclonal mouse anti-human CD68 | Dako | M071801 | optimized at 1:200 |
| Polyclonal rabbit anti-CD3 | Agilent Dako | A0452 | optimized at 1:100 |
| Polymer goat anti- rabbit/mouse secondary antibody | Dako | ||
| Placental tissue | for FRB positive control |
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