Protokollen illustrerer bruken av histopathologic undersøkelse og immunohistochemistry profilen folat reseptor beta macrophage og dens forhold til totalt immun-cellen infiltrere i timelige arterien biopsier i gigantiske celle arteritt.
Gigantiske celle arteritt (GCA) er en kronisk immun-mediert sykdom av middels til store store arterier som påvirker eldre voksne. GCA manifester med leddgikt og occlusive symptomer hodepine, hjerneslag eller visjonen tap. Makrofager og T-helper lymfocytter infiltrere vaskulære veggen og produsere en pro-inflammatoriske respons som fører til fartøyet skade og ischemia. Hittil er det ingen GCA biomarkør som kan overvåke sykdom aktivitet og guide terapeutiske svar.
Folat reseptor beta (FRB) er et glycosylphosphatidylinositol protein som er forankret på celle membraner og vanligvis uttrykt i myelomonocytic avstamning og i fleste myelogen leukemi cellene også svulst og Revmatoid synovial makrofager, der uttrykket samsvarer med sykdommens alvorlighetsgrad. Evne til FRB binde folat forbindelser, folsyre-conjugates og antifolate narkotika har gjort det en druggable mål i kreft og betennelsessykdom forskning. Denne rapporten beskriver metodene histopathologic og immunohistochemical brukes til å vurdere uttrykk og distribusjon av FRB i forhold til GCAimmunopathology.
Formalin-fast og parafin-embedded timelige arterien biopsier fra GCA og vanlige kontrollene var farget med Hematoxylin og Eosin å vurdere vev histology og Patognomonisk funksjoner. Immunohistochemistry ble brukt til å oppdage FRB, CD68 og CD3 uttrykk. En microscopic analyse ble utført for å kvantifisere antall positivt farget celler på 10 utvalgte høy-power-feltet deler og deres respektive steder i arterieveggen.
Lymphohistiocytic (LH) betennelse ledsaget av intimal hyperplasia og forstyrret elastisk lamina ble sett i GCA med ingen i kontroller. LH infiltrere var sammensatt av ca 60% lymfocytter og 40% makrofager. FRB uttrykk var begrenset til makrofager, som består av 31% av den totale CD68 + macrophage befolkningen og lokalisert til media og adventitia. Ingen FRB ble sett i kontroller.
Denne protokollen vist en distinkte numeriske og romlig mønster av FRB macrophage i forhold til det vaskulære immun microenvironment i GCA.
Gigantiske celle arteritt (GCA) er en betennelsessykdom i middels til store arteriene, målretting aorta og dens forgreninger og påvirker eldre voksne. Den presenterer med mild til alvorlig iskemiske komplikasjoner som hodepine, kjeve smerter, synstap, hjerneslag og vev koldbrann. Diagnosen er bekreftet av høy inflammatoriske markører som røde blodlegemer sedimentasjonsrate (SR) og et distinkt histopathologic mønster på timelige arterien biopsi (TAB)1. GCA er den vanligste voksen vaskulitt tilgjengelighet i timelige arterien innhentet for diagnose presenterer en fordel over andre vasculopathies, dermed muliggjør en studere sin patogenese lettere. Typisk resultatene kategorien inkluderer en infiltrere makrofager/histiocytter og T-lymfocytter funnet over alle vaskulære lag av tunika intima, media og adventitia med samtidig ødeleggelse av den elastiske lamina som vanligvis skiller dette rom2. Dagens bevisene viser at GCA innebærer et ukjent antigen som aktiverer dendrittiske celler i det vaskulære adventitia, etterfulgt av rekruttering av hjelper T (Th) celler, spesielt Th1 og Th17 undertypene som skiller interleukin-17 og plasma interferon-gamma (IFG) henholdsvis. IFG så rekrutterer og aktiverer makrofager å produsere cytokiner og proteaser. Disse inkluderer pro-inflammatoriske cytokiner; inkludert IL-12, som aktiverer gjensidig Th1 celler dermed gir en positiv feedback loop; tumor nekrose faktor og interleukin-6, som forårsaker artritt og fevers og metalloproteases som skade den elastiske lamina. Glukokortikoider (GC), som utgjør standard kronisk terapi, kontrollere delvis cytokin veier av demping Th17/IL-17 men ikke Th1/IFG armen av immunrespons3,4. Dessverre seponering av GC resulterer i sykdommen tilbakefall. Som et alternativ modalitet, methotrexate har blitt repurposed for GCA behandling, men ønsket klinisk endepunktene ble ikke konsekvent oppnådd selv om mer følsomme biomarkers ikke har vært benyttet for terapeutisk overvåking5,6 . I 2017, ble interleukin 6 blokkering, tocilizumab, godkjent for behandling av GCA som det effektivt demonstrert sykdomskontroll og steroid sparsom effekter7,8.
Hittil er det ingen bra biomarkers for GCA. Som et resultat, er det vanskelig å overvåke sykdomsaktivitet og sjarmere doser av tilgjengelige narkotika å unngå bivirkninger og redusere byrden av kostnader for samfunnet. Derfor er det viktig å se etter en kandidat biomarkør som samsvarer med sykdomsaktivitet, gi romanen innsikt i patogenesen og bistand i terapeutisk beslutninger.
Feilregulering macrophage aktivisering er en kritisk faktor i GCA patogenesen. Dermed kan et effektivt middel for behandling av GCA være selektiv målrettingen aktivert makrofager. Folat reseptor beta (FRB) er en glycosyl-phosphatidylinositol glykoprotein som er forankret i cellemembranen uttrykt i normal myelomonocytic celler, myelogen leukemi celler og aktivert makrofager. Ligand, folsyre, er en viktig vitamin i formen, som gjør mobilnettet DNA syntese, metylering og reparasjon9. FRB uttrykk er indusert i autoimmune sykdommer og under kreft. Uttrykket er begrenset til overflaten av monocytter eller pro-inflammatoriske M1 makrofager i revmatoid artritt eller anti-inflammatorisk M2 makrofager i solid orgel og myelogen malignitet10,11,12 , 13. i tillegg til sin potensielle rolle som en biomarkør av aktivert makrofager, FRB kan aktivere selektiv narkotika transport gjennom en flertrinnsprosess som starter med reseptor bindingen til folinsyre, antifolates eller folat-konjugerte medisiner på cellen overflaten, etterfulgt av internalisering, utgivelse og eventuell levering av ønsket stoffet til interne celle maskiner12,14,15,16. I motsetning til FRB uttrykt i kreftceller og aktivert makrofager, FRB uttrykt i normal blodkreft cellene kan ikke binde folates og dermed sikre at FRB/folat-mediert narkotika-leveranser er begrenset til FRB-positive inflammatoriske eller kreftceller.
I vår forrige studie vi viste for første gang som FRB uttrykkes i GCA makrofager og uttrykket korrelert med CD68 + og endothelin reseptor beta makrofager, som bidrar til GCA patogenesen17. I denne rapporten beskriver vi de histopathological og immunohistochemical metoder brukes til å vurdere FRB macrophage og analysert de totale lymfocytt og macrophage teller for å få innsikt i den FRB posisjon i GCA vaskulære landskapet.
GCA er den vanligste vaskulitt i voksne og sin patologisk hallmark eksemplifiserer en potent kombinasjon av T-lymfocytter helper og aktivert makrofager som kan også finnes i andre granulomatøs sykdommer eller vasculopathies som Sarkoidose og granulomatøs polyangiitis2,3. I GCA, timelige arterien gir en god representasjon av en middels til store store arterien og TA biopsi gir en betydelig utvalg som kan lagres i parafinblokkene år dermed skape muligheter til …
The authors have nothing to disclose.
Dette arbeidet ble gjort mulig med støtte fra Dr. Douglas Stairs, Marianne Klinger, Ann Benko, avdeling av Rheumatology/Institutt for medisin og molekylære og Histopathologic kjernelaboratorium, Penn State University College of Medicine, Hershey PA.
Microtome | Reichert-Jung | ||
plain and frosted microscope slides and cover slips | Fisher Scientific | ||
Vertical rack | Fisher Scientific | ||
Light microscope | Olympus BX60 microscope | ||
Xylene | |||
Acetone in distilled water | concentrations 100%, 90%, 70% | ||
Tris-buffered saline solution (TBS) | Dako Wash BufferS3006 | ||
3% hydrogen peroxide in TBS | |||
Diaminobenzidine (DAB) | Sigma Fast Tablet set | ||
Chemical Permount Mounting Medium | Fisher Scientific | SP-15-100 | |
Harleco Gill's III Hematoxylin | Fiisher Scientific 23-750-019 | ||
Harleco Eosin Y 1% Alcoholic Stock Solution | Fisher Scientific | 23-749-977 | |
10 mM citric acid monohydrate (pH 6.0) | |||
Polyclonal rabbit anti-folate receptor beta | Manohar Ratnam | optimized at 1:800 | |
Monoclonal mouse anti-human CD68 | Dako | M071801 | optimized at 1:200 |
Polyclonal rabbit anti-CD3 | Agilent Dako | A0452 | optimized at 1:100 |
Polymer goat anti- rabbit/mouse secondary antibody | Dako | ||
Placental tissue | for FRB positive control |