Eine Immunohistopathologic Untersuchung der Folat-Rezeptor Beta Makrophagen und vaskuläre immun Mikroumgebung in riesige Zelle Arterienentzündung Profil
Summary
Das Protokoll zeigt die Verwendung der histologischen Untersuchung und immunhistochemische Profil Folat Rezeptor Beta-Makrophagen und seine Beziehung zu der gesamten Immunzelle Schläfenarterie Biopsien in riesige Zelle Arterienentzündung zu infiltrieren.
Abstract
Riesige Zelle Arterienentzündung (GCA) ist eine chronische immunvermittelte Erkrankung des Mittel-groß dimensionierte Arterien, die ältere Erwachsenen betrifft. GCA Manifeste mit Arthritis und okklusive Symptome von Kopfschmerzen, Schlaganfall oder vision Verlust. Makrophagen und T-Helfer-Lymphozyten die Gefäßwand zu infiltrieren und eine Pro-inflammatorische Reaktion, die zu Schiff Schaden und Ischämie führen zu produzieren. Bisher gibt es keine GCA-Biomarker, die Krankheit Aktivität und Guide therapeutische Reaktion überwachen können.
Folat-Rezeptor-Beta (FRB) ist ein Glycosylphosphatidylinositole Protein, das auf Zellmembranen verankert ist und normalerweise ausgedrückt in der Myelomonocytic Linie und in der Mehrzahl der myeloischen Leukämie-Zellen sowie in Tumor und rheumatoide synovialen Makrophagen, wo seinen Ausdruck mit der Schwere der Erkrankung korreliert. Die Fähigkeit der FRB, Folat Verbindungen, Folsäure-Konjugate und Strukturähnliche Medikamente binden hat es ein druggable Ziel in Krebs und entzündliche Erkrankung Forschung gemacht. Dieser Bericht beschreibt die histologischen und immunhistochemische Methoden verwendet, um Ausdruck und Verteilung der FRB in Bezug auf GCAimmunopathology zu bewerten.
Formalin fixiert und Paraffin-eingebetteten Schläfenarterie Biopsien von GCA und normalen Kontrollen waren voller Flecken mit Hämatoxylin und Eosin prüfen Gewebe Histologie und pathognomonische Funktionen ermitteln. Immunohistochemistry diente, FRB, CD68 und CD3 Ausdruck zu erkennen. Eine mikroskopische Analyse wurde durchgeführt, um die Anzahl der positiv gefärbten Zellen auf 10 ausgewählten high-power-Bereich Sektionen und ihre jeweiligen Standorte in der Arterienwand zu quantifizieren.
Lymphohistiocytic (LH) Entzündung begleitet von Intima-Hyperplasie und gestörten elastischen Lamina galt in GCA mit keine Kontrollen gefunden. Das LH Infiltrat bestand aus ca. 60 % Lymphozyten und 40 % Makrophagen. FRB Ausdruck beschränkte sich auf Makrophagen, bestehend aus 31 % der CD68 + Makrophagen Gesamtbevölkerung und in der Media und Adventitia lokalisiert. Keine FRB wurde in Steuerelementen gesehen.
Dieses Protokoll zeigt ein eindeutiges numerisches und räumliche Muster der FRB Makrophagen im Verhältnis zu der vaskulären immun Mikroumgebung in GCA.
Introduction
Riesige Zelle Arterienentzündung (GCA) ist eine entzündliche Erkrankung des mittleren bis großen Arterien, targeting der Aorta und seine Niederlassungen und ältere Erwachsene betroffen. Es stellt mit leichten bis schweren ischämischen Komplikationen wie Kopfschmerzen, Kieferschmerzen, Verlust der Sehkraft, Schlaganfall und Gewebe Gangrän. Die Diagnose wird durch hohe Entzündungsmarker wie Erythrozyten Sedimentation Rate (ESR) und ein eindeutiges histologischen Muster auf der Schläfenarterie Biopsie (TAB)1bestätigt. GCA ist die häufigste Vaskulitis Erwachsenen, und die Zugänglichkeit der Schläfenarterie erhalten für die Diagnose stellt einen Vorteil gegenüber anderen Vasculopathies, so dass man seine Pathogenese leichter zu studieren. Die typische Ergebnisse auf Registerkarte “beinhalten ein Infiltrat von Makrophagen/Histiozyten und T-Lymphozyten über alle vaskulären Schichten der Tunica Intima, Media und Adventitia mit gleichzeitiger Zerstörung der elastischen Lamina, die normalerweise diese trennt gefunden Fächer2. Die aktuelle Beweise zeigt, dass GCA ein unbekanntes Antigen beinhaltet, die dendritische Zellen in der vaskulären Adventitia aktiviert, gefolgt von der Einstellung des Helfers T (Th) Zellen, insbesondere Th1 und Th17-Subtypen, die absondern Interleukin-17 und Interferon-Gamma (IFG) beziehungsweise. IFG dann rekrutiert und aktiviert Makrophagen produzieren Zytokine und Proteasen. Dazu gehören Pro-inflammatorischen Zytokinen; einschließlich der IL-12, die wechselseitig Th1 Zellen, wodurch eine positive Rückkopplung aktiviert; Tumor-Nekrose-Faktor und Interleukin-6, die Arthritis und Fieber und Metalloproteasen, die verursachen Schäden der elastischen Lamina. Glukokortikoide (GC), die die Standardtherapie der chronischen darstellen, Steuern die Cytokine Bahnen teilweise mildernde Th17/IL-17, aber nicht die Th1/IFG Arm der Immunantwort3,4. Leider führt Absetzen des GC Rückfall der Erkrankung. Als alternative Modalität Methotrexat hat für GCA Behandlung umgewidmet worden, aber die gewünschte klinische Endpunkte wurden nicht konsequent erreicht, obwohl empfindlicher Biomarker für therapeutischen Überwachung5,6 nicht verwendet worden sein . Im Jahr 2017 wurde die Interleukin 6-Blocker, Tocilizumab, für die Behandlung von GCA genehmigt, wie effektiv Krankheitskontrolle und schonende Wirkung7,8Steroid nachgewiesen.
Bisher gibt es keine guten Biomarker für GCA. Infolgedessen ist es schwierig, zur Überwachung der Krankheitsaktivität und titrieren Dosen von verfügbaren Medikamenten, um negative Auswirkungen zu vermeiden und reduzieren die Belastung der Kosten für die Gesellschaft. Daher ist es unerlässlich, ein Kandidat Biomarker, dass korreliert mit Krankheitsaktivität, bieten neue Einblicke über die Pathogenese und Hilfe bei therapeutischen Entscheidungen suchen.
Die Dysregulation der Makrophagen Aktivierung ist ein kritischer Faktor in der Pathogenese der GCA. So kann ein wirksames Mittel zur Behandlung von GCA sein die gezielte Ausrichtung der aktivierten Makrophagen. Die Folsäure-Rezeptor-Beta (FRB) ist ein a1-Phosphatidylinositol-Glykoprotein, das auf der Zellmembran verankert ist in normalen Myelomonocytic Zellen, myeloische Leukämie-Zellen exprimiert und aktiviert Makrophagen. Die Liganden, Folsäure, ist ein wichtiges Vitamin in seiner reduzierten Form, der zelluläre DNA-Synthese, Methylierung und Reparatur9ermöglicht. FRB-Ausdruck wird in Autoimmunerkrankung und während der Karzinogenese induziert. Ihr Ausdruck ist auf der Oberfläche von Monozyten oder Pro-inflammatorischen M1 Makrophagen bei rheumatoider Arthritis oder auf entzündungshemmende M2-Makrophagen beschränkt in festen Orgel und myeloischen malignen Erkrankungen10,11,12 , 13. neben ihrer möglichen Rolle als Biomarker der aktivierten Makrophagen, FRB können selektive Drug Transport durch einen mehrstufigen Prozess, der mit die Rezeptorbindung, Folsäure, Antifolates oder Folat konjugiert Drogen an der Zelle beginnt Oberfläche, gefolgt von Verinnerlichung, Freigabe und eventuelle Lieferung des gewünschten Medikaments an die interne Zelle Maschinen12,14,15,16. Im Gegensatz zu FRB in Krebszellen exprimiert und aktiviert Makrophagen, FRB in normalen blutbildenden Zellen exprimiert ist nicht in der Lage zu binden Folate damit FRB/Folat-vermittelten Drug-Delivery FRB-positiven entzündlichen oder Krebszellen beschränkt.
In unserem vorangegangenen Studie zeigten wir zum ersten Mal, das FRB in GCA Makrophagen zum Ausdruck bringt und seinen Ausdruck korreliert mit CD68 + und Endothelin Rezeptor Beta-Makrophagen, die GCA Pathogenese17beitragen. In diesem Bericht beschreiben wir die histopathologische und immunhistochemische Methoden zur Beurteilung der FRB Makrophagen und analysiert den gesamten Lymphozyten und Makrophagen zählt, um Einblick in die FRB Position in der GCA vaskulären Landschaft.
Protocol
Representative Results
Discussion
GCA ist die häufigste Vaskulitis bei Erwachsenen, und pathologische Wahrzeichen steht beispielhaft für eine wirkungsvolle Kombination von T-Helfer-Lymphozyten und aktiviert Makrophagen, die auch in andere granulomatöse Erkrankungen oder Vasculopathies wie Sarkoidose gefunden werden können und granulomatöse Polyangiitis2,3. In GCA, die Schläfenarterie bietet eine gute Darstellung einer Mittel-groß dimensionierte Arterie und die TA-Biopsie gibt eine große P…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wurde durch die Unterstützung von Dr. Douglas Stairs, Marianne Klinger, Ann Benko, der Abteilung Rheumatologie/Abteilung Medizin und Molekularbiologie und histologischen Zentrallabor, Penn State University College of Medicine, Hershey PA.
Materials
| Microtome | Reichert-Jung | ||
| plain and frosted microscope slides and cover slips | Fisher Scientific | ||
| Vertical rack | Fisher Scientific | ||
| Light microscope | Olympus BX60 microscope | ||
| Xylene | |||
| Acetone in distilled water | concentrations 100%, 90%, 70% | ||
| Tris-buffered saline solution (TBS) | Dako Wash BufferS3006 | ||
| 3% hydrogen peroxide in TBS | |||
| Diaminobenzidine (DAB) | Sigma Fast Tablet set | ||
| Chemical Permount Mounting Medium | Fisher Scientific | SP-15-100 | |
| Harleco Gill's III Hematoxylin | Fiisher Scientific 23-750-019 | ||
| Harleco Eosin Y 1% Alcoholic Stock Solution | Fisher Scientific | 23-749-977 | |
| 10 mM citric acid monohydrate (pH 6.0) | |||
| Polyclonal rabbit anti-folate receptor beta | Manohar Ratnam | optimized at 1:800 | |
| Monoclonal mouse anti-human CD68 | Dako | M071801 | optimized at 1:200 |
| Polyclonal rabbit anti-CD3 | Agilent Dako | A0452 | optimized at 1:100 |
| Polymer goat anti- rabbit/mouse secondary antibody | Dako | ||
| Placental tissue | for FRB positive control |
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