Listeria monocytogenes Infecção do cérebro
Summary
Durante a infecção, a Listeria monocytogenes é capaz de atravessar a barreira hemato – encefálica para colonizar o cérebro. Neste protocolo, demonstramos como avaliar a colonização bacteriana de órgãos após a infecção de camundongos. Está previsto um procedimento para executar a perfusão de órgão inteiro para determinação específica dos números bacterianas do parênquima cerebral.
Abstract
Listeria monocytogenes é um patógeno bacteriano intracelular que está frequentemente associado com infecção de origem alimentar. A capacidade de L. monocytogenes de atravessar a barreira hemato – encefálica (BBB) é relativo, pode levar a risco de vida meningite e encefalite. O BBB protege o microambiente do cérebro de vários metabólitos tóxicos e patógenos microbianos no sangue após a infecção e, portanto, suporta a homeostase do cérebro. Os mecanismos pelos quais L. monocytogenes presente na corrente sanguínea cruzar o BBB para causar cérebro infecções não são totalmente compreendidas e há também a falta de um sistema de modelo robusto para estudar infecções cerebrais por L. monocytogenes. Aqui, apresentamos um modelo de infecção de mouse simples para determinar se as bactérias cruzaram o BBB e para dosar a carga de bactérias que colonizaram o cérebro em vivo. Neste método, os animais foram infectados por via intravenosa com L. monocytogenes em humanamente foram sacrificados por exposição ao CO2 , seguido por deslocamento cervical. Perfusão cardíaca dos animais foi realizada antes da colheita de órgãos infectados. Sangue foi coletado antes da perfusão e o número de bactérias por órgão ou mL de sangue foi determinada por chapeamento diluições do sangue ou órgão homogenates em placas de ágar e contando o número de colônias formadas. Esse método pode ser usado para estudar interações ligante-receptor romance que aumentam a infecção do cérebro por L. monocytogenes e podem ser facilmente adaptado para o estudo de vários patógenos bacterianos.
Introduction
A bactéria Gram-positiva Listeria monocytogenes é um patógeno intracelular facultativo e um dos maioria dos mortais comida patógenos em todo o mundo. Ingestão de alimentos de L. monocytogenes contaminado pode levar a listeriose em humanos, uma grave doença invasiva visando principalmente grávidas, os recém-nascidos, os indivíduos idosos e imunocomprometidos1. L. monocytogenes está entre as principais causas de morte por um patógeno de origem alimentar nos Estados Unidos e taxas de fatalidade casos de listeriose são tão elevadas como 20 a 30%, o mais elevado para todos os agentes patogénicos de origem alimentar2. Nenhuma vacina atualmente existe para L. monocytogenes e a capacidade das bactérias para efetivamente espalhou para o cérebro e órgãos distais por atravessar a barreira hemato – encefálica (BBB) pode levar a risco de vida meningite e colonização do cérebro3 , 4 , 5 , 6. meningite bacteriana é geralmente severa; enquanto a maioria das pessoas que recebem tratamento recuperam, infecções podem causar sérias complicações, por exemplo, danos cerebrais, perda de audição ou dificuldades de aprendizagem em crianças. L. monocytogenes é previsto compensar pelo menos 10% de toda a Comunidade adquiriu meningite no EUA7.
Uma importante rota para a disseminação bacteriana para o cérebro e as meninges é através da corrente sanguínea. Bactérias circulantes em vasos sanguíneos no cérebro são capazes de atravessar o BBB para causar infecção cerebral. O BBB é um sistema altamente vascularizado barreira que protege o cérebro de partículas estranhas que circulam no sangue. Células endoteliais constituem uma camada que reveste a superfície interior do vasos sanguíneos8,9. Além de L. monocytogenes, vários agentes patogénicos bacterianos como Neisseria meningitidis, Streptococcus pneumoniae, Escherichia colie Haemophilus influenzae tipo b (Hib) são capazes de colonizar o cérebro através do cruzamento do BBB3,4,5,6. No entanto, ao examinar a carga bacteriana no cérebro de ratos infectados, é importante determinar que se as bactérias cruzaram o BBB, caso contrário a carga bacteriana no cérebro pode representar as bactérias que são ainda nos vasos sanguíneos do cérebro. Assim, é necessário perfundir os ratos de todo o sangue antes da determinação de unidades formadoras de Colônia (UFC) dos homogenates do cérebro.
Neste estudo, descrevemos na vivo métodos para examinar a infecção de L. monocytogenes do cérebro. Para os métodos descritos aqui, usamos a L. monocytogenes estirpe 10403S. L. monocytogenes 10403S é uma das variedades de laboratório mais amplamente utilizado para estudar a listeriose sistêmica no modelo do rato de infecção10. Este protocolo é baseado em padrão injecção intravenosa de L. monocytogenes , seguido de perfusão dos ratos. Um esboço esquemático do protocolo de infecção em camundongos é mostrado na Figura 1. L. monocytogenes-cérebros infectados e outros órgãos de ratos perfundidos ou não perfundidos foram coletados e a carga bacteriana órgão determinado. Esses métodos são úteis para determinar não só a colonização bacteriana total do cérebro de animais infectados, mas também são benéficos para determinar se a bactéria ter penetrado o BBB na vivo para mediar a invasão do cérebro. É importante salientar que este protocolo do laboratório deve ser realizado após consulta com a gestão de instalações de biossegurança institucional relevante Comissão e animal.
Protocol
Representative Results
Discussion
L. monocytogenes é capaz de causar meningoencefalite fatais em seres humanos. Estudos prévios têm demonstrado a capacidade das bactérias para atravessar a sangue-cérebro-barreira (BBB) e a colonizar o cérebro. Três rotas de invasão do cérebro têm sido propostas durante a infecção: direto a penetração do BBB por bactérias, stealth transporte por bactérias contidas dentro de células mononucleares3e migração axonal por cepas de L. monocytogenes que causam rhombenc…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabalho foi apoiado pelo serviço de saúde pública dos EUA conceder AI103806 do National Institutes of Health.
Materials
| Brain Heart Infusion media | Becton Dickinson | 237200 | |
| Streptomycin sulfate | Amresco | 0382-50G | |
| Petri dishes | VWR | 25384-342 | |
| Glycerol | VWR | 97062-832 | |
| IKA T18 ULTRA-TURRAX Basic Homogenizer | IKA | 3352109 | Model: T18BS1 |
| Spectrophotometer | Beckman Coulter | DU 800 series | |
| BALB/c mice | Jackson Laboratory | Model #000651 | |
| 1 mL syringes | Becton Dickinson | 309659 | |
| 26-gauge needles | Becton Dickinson | 305115 | |
| 21-gauge butterfly needles | Becton Dickinson | 367281 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid | Sigma-Aldrich | 60004 | |
| 15 mL conical tubes | VWR | 21008-918 | |
| Round-bottom test tubes | VWR | 60819-546 | |
| Phosphate-buffered saline | Corning | 46-013-CM | |
| Stainless steel spatula | VWR | 82027-520 | |
| Stainless steel scissors (6.5 in) | VWR | 82027-592 | |
| Stainless steel scissors (4.5 in) | VWR | 82027-578 | |
| Stainless steel blunt forceps (4.5 in) | VWR | 82027-440 | |
| Stainless steel fine tip forceps (6 in) | VWR | 82027-406 |
Riferimenti
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