낮은 산소 환경에서 인간 대 식 세포 분극의 Proteomic 분석
Summary
우리는 인간의 세포의 proteomic 서명을 macrophage 분극에 낮은 산소 환경 영향의 결정에이 적용 하는 프로토콜을 제시.
Abstract
대 식 세포는 타고 난 면역 세포 조직의 항상성 전염 성 병원 균에 대 한 응답에서 배열 하는 생리 기능 수에 관련 된. 이러한 셀의 다양 한 기능 활성화 상태로 또한 양극 화 라는 관련이 있습니다. 이러한 다양 한 분극의 정확한 분자 설명 대 식 세포 생물학의 분야에서 우선 순위입니다. 그것은 현재 다차원 접근은 분극 환경 신호에 의해 제어 되는 방법을 설명 하는 데 필요한 인정 했다. 이 보고서에서 우리는 인간의 세포에 다양 한 분극의 proteomic 서명을 얻기 위해 설계 된 프로토콜을 설명 합니다. 이 프로토콜은 대 식 세포 단백질 표정에-젤 분류 한 내용과 리스 C/트립 신-소화 세포 세포의 용 해에서 얻은의 레이블 없는 정량화를 기반으로 합니다. 우리는 또한 프로토콜 기반 솔루션에서 소화 하 고 전자 안으로 사용 하는 분류를 초점을 제공 합니다. 산소 농도 조직에 관련 된 환경 매개 변수, 때문에 우리는 어떻게 대기 구성 탐험이 프로토콜을 사용 또는 저 산소 환경에 영향을 미치는 macrophage 분극의 분류.
Introduction
대 식 세포는 여러 전염 성 병원 균에 대 한 응답에서 조직의 항상성, apoptotic 세포의 제거를 포함 하 여, 세포 외 기질1의 리 모델링에 이르기까지 생리 기능에 타고 난 면역 세포. 이 세포는 강한 phenotypic가 소성2 분극 라고도 하는 많은 가능한 활성화 상태를 변환 하는 특징. 이러한 다양 한 분극의 정확한 분자 설명 대 식 세포 생물학3의 분야에서 우선 순위입니다. 그것은 소위 M1/M2 이분법, 있는 m 1 프로-염증 성 나타내고 M2 염증 세포를 사용 하 여 이러한 분극 분류 제안 되었습니다. 이 모델은 급성 감염, 알레르기, 비만4같은 다양 한 병 적인 상황에 잘 맞는. 그러나, 만성 염증된 조직 및 암, 그것은 증명 되었습니다이 분류는 대 식 세포 특정 세포 환경5,6, 에서 제공 하는 광범위 한 phenotypic 레 퍼 토리를 파악 수 없습니다. 7. 현재 일치는 대 식 세포 양극 화 더 나은 설명 다차원 모델을 사용 하 여 특정 microenvironmental 신호8을 통합 하는. 이 결론은 M1/M2 모델은 획득된 분극9에 비효율적 보여주는 인간 대 식 세포의 transcriptomic 분석을 통해 확인 됐다.
연구를 인간의 세포에 다양 한 분극의 proteomic 서명 프로토콜을 제공 하는 것을 목표로 제시. 우리는 다양 한 산소 레벨의 환경에 인간의 세포를 분화 하 고 레이블 없는 정량화를 수행 하기 위해 전체 대 식 세포 프로테옴에서 펩 티 드를 얻을 하는 방법을 설명 합니다. 이 정량화 다양 한 단백질의 표현 레벨의 비교를 허용 한다. 줄기 세포에 대 한 연구 환경 키 매개 변수10으로 산소의 중요성을 계시 했다, 우리는이 조직 매개 변수 인 간에 있는 대 식 세포 분극 영향을 미칠 수 어떻게 이해를 추구 합니다. 산소의 부분 압력에서에서 발견 되었습니다 범위 3 (총 대기 압력)의 20% ~ 20% (정확한 값은 약 18.6% 물의 존재 하면서 세포 문화 인큐베이터에서 일반적으로 사용 되는 약 해당 인체 에 계정).
이전 작품과 형태학의 조회11 지점과 이러한 차이 아마 부분적으로는 그들은 노출된12다른 산소 수준 때문에 치경 다 기능에서 중간 세포를 보이고 있다. 또한, 골 수 유래 세포 박테리아12낮은 산소 환경 노출 되 면 phagocytize를 증가 능력을 보여줍니다. 인간의 세포 THP1 차별화 된13, 반대의 효과가 발견 되었습니다 있지만 이러한 결과 산소 대 식 세포 생물학의 레 귤 레이 터는 고 인간의 세포에 분자 수준에서이 역할을 명확히 하는 데 필요한 아이디어를 지 원하는. 이전 연구에서 우리는 이러한 문제를 해결 하는 proteomics 접근 방식을 적용 했습니다. 단백질의 수천에 대 한 식 레벨을 동시에 측정 하 여 우리는 분극에 산소의 영향을 강조 하 고 새로운 분자 마커의 목록을 제공. 우리는 또한 일부 세포 기능에 이러한 연구 결과 관련 된 수 있습니다. 특히, 우리는 apoptotic 세포의 식 균 작용의 속도 증가 되었다 IL4/IL13-편광 세포에서 밝혀 proteomic 분석14ALOX15의 upregulation에 연결 했다 발견. 현재 연구에서 우리는 이러한 분석을 수행 하는 방법을 설명 합니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
Proteomics 전체 셀 또는 subcellular 구획에서 다른 단백질의 표현을 공부 하는 강력한 도구 이므로 세포 세포의 용 해 프로토콜의 최적화 및 단백질의 소화 연구의 숫자에 의해 수정 되었습니다. 젤 소화 (polyacrylamide 젤 매트릭스에 단백질의 소화)17, 솔루션18 및 필터 지원 샘플 준비19에서 소화를 포함 하는 방법의 세 가지 주요 클래스 있다. 이 마지…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
오전 국가 리그 죄수 르 암과 라 Fondation 아크 부 라 검색 쉬르 르 암 라 하 여 젊은 그룹 지도자 프로그램 (ATIP/미래 Inserm-CNRS)에 의해 자금이 다. 우리는 생물학 플랫폼 (UTECHS MSBIO, 파스퇴르 연구소, 파리)에 대 한 질량 분석에서 Mariette Matondo 감사합니다. 우리는 원고의 그녀의 독서에 대 한 로렌 앤더슨을 감사합니다.
Materials
| Hypoxia Working Station | Oxford Optronix | Hypoxylab | |
| C6 Flow cytometer | BD | Accuri C6 | |
| Urea | Agilent Technologies | 5188-6435 | |
| Formic acid (FA) | ARISTAR | 450122M | |
| R-250 Coomassie blue | Biorad | 1,610,436 | |
| Lipopolysaccharide, E.Coli (LPS) | Calbiochem | 437627 | |
| 2D clean-up kit | GE Healthcare | 80-6484-51 | |
| RPMI 1640 medium, glutamax supplement | Gibco | 61870044 | |
| HEPES 1 M | Gibco | 15630-080 | |
| MEM Non-Essential Amino Acids (NEAA) Solution 100X | Gibco | 11140-035 | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) 1X | Gibco | 14190-094 | |
| Harvard Apparatus column Reverse C18 micro spin column | Harvard Apparatus | 74-4601 | |
| EDTA 0.5 M, pH 8.0 | Invitrogen | AM9260G | |
| NuPAGE Bis-Tris 4-12% | Life Technologies SAS | NP0321 BOX | |
| CD14 Microbeads human | Miltenyi Biotec | 130-050-201 | |
| MACS separation column LS | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | |
| Macrophage colony-stimulating factor (M-CSF) | Miltenyi Biotec | 130-096-485 | |
| Interleukin 4 (IL4) | Miltenyi Biotec | 130-093-917 | |
| Interleukin 13 (IL13) | Miltenyi Biotec | 130-112-410 | |
| Interferon gamma (INFγ) | Miltenyi Biotec | 130-096-482 | |
| CD14-FITC (clone TÜK4) | Miltenyi Biotec | 130-080-701 | |
| MACSmix Tube Rotator | Miltenyi Biotec | 130-090-753 | |
| Trifluoroacetic Acid (TFA) | Pierce | 28904 | |
| Trypsin/Lys-C Mix | PROMEGA | V5073 | |
| Complete Mini, EDTA-free Protease Inhibitor cocktail | Roche | 11836170001 | |
| Density Gradient Solution (Histopaque 1077) | Sigma Aldrich | 10771-100ML | |
| Accumax | Sigma Aldrich | A7089-100ML | |
| Human Serum from human male AB plasma (SAB) | Sigma Aldrich | H4522-100ML | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) solution 30% | Sigma Aldrich | A9576-50ML | |
| Trisma-base | Sigma Aldrich | T1503 | |
| Glycerol | Sigma Aldrich | 49767 | |
| β-Mercaptoethanol | Sigma Aldrich | M3148 | |
| Bromophenol blue | Sigma Aldrich | 114405 | |
| Sodium Dodecyl Sulfate (SDS) 20% | Sigma Aldrich | 5030 | |
| Ammonium bicarbonate | Sigma Aldrich | 9830 | |
| Acetonitrile | Sigma Aldrich | 34888 | |
| Dithiothreitol | Sigma Aldrich | 43819 | |
| Iodoacetamide | Sigma Aldrich | 57670 | |
| Thiourea | Sigma Aldrich | T8656 | |
| CHAPS | Sigma Aldrich | C9426 | |
| Micro BCA Assay Kit | ThermoFisher | 23235 | |
| 5 mL sterile plastic pipette | VWR | 612-1685 | |
| Thermomixer C Eppendorf | VWR | 460-0223 | |
| Sep-Pak tC18 reverse phase cartridges, 100 mg | Waters | WAT036820 |
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