Vi har tidligere brugt en guld nanopartikel peptid hybrid intravenøst levere en syntetisk peptid, protein kinase C-delta hæmmer, hvilket reducerede iskæmi-reperfusion-induceret akut lunge skade. Her viser vi de detaljerede protokollen af narkotika formuleringen. Andre intracellulære peptider kan være formuleret på samme måde.
Protein kinase C-delta hæmmer (PKCδi) er en lovende stof iskæmi-reperfusion-induceret orgel skade. Det er normalt konjugeret med en celle-gennemtrængende peptid, TAT, intracellulære levering. TAT har dog vist ikke-specifikke biologiske aktiviteter. Guld nanopartikler (BNI) kan bruges som drug delivery luftfartsselskaber uden anerkendt toksicitet. Derfor har vi brugt en GNP/peptid hybrid til at levere PKCδi. To korte peptider (P2: CAAAAE og P4: CAAAAW), i forholdet 95:5 blev brugt til at redigere egenskaberne overflade af BNI. BNI konjugeret med PKCδi (GNP/PKCi) er stabil i destilleret vand, 0,9% NaCl og fosfatbufferet saltopløsning (PBS) med bovin serum albumin eller føtal bovint serum. Intravenøs injektion af GNP-PKCi var tidligere vist at forhindre iskæmi-reperfusion skade af lungen. Denne artikel beskriver en protokol for at formulere GNP/PKCi og vurdere lægemiddels egenskaber af GNP/PKCi. Vi har brugt lignende metoder til at formulere andre peptid-baserede lægemidler med BNI. Denne artikel vil forhåbentlig gøre mere opmærksom på denne roman intracellulære drug delivery teknologi og dens anvendelsesmuligheder in vivo.
Lunge transplantation sparer patienter med slutstadiet lunge sygdom1. Alvorlige komplikationer efter lunge transplantation er dog stadig en hindring. I de tidlige faser efter lunge transplantation, primære graft dysfunktion er den mest skadelige komplikation1, og dens primære årsag er iskæmi-reperfusion (IR)-induceret akut lunge skade2.
Under kolde bevarelse er stofskifte i en donor lunge begrænset til et meget lavt niveau. Dog er reaktive ilt arter og nitrogenoxid syntesen aktiveret som følge af ophør af blod flow3. Efter transplantation, blodcirkulationen er restaureret og reaktive ilt arter og nitrogenoxid genereret under kolde iskæmi forbedre betændelse og celle død, hvilket resulterer i vævsskade.
For at forhindre IR skade, har en protein kinase Cδ hæmmer (PKCδi) været anvendt i hjertet, hjernen og lungekræft4,5,6,7,8. Disse undersøgelser viste, at PKCδi faldt betændelse og apoptose i reperfusion. Det har også forhindret pulmonal IR skade i rotter og i en lunge transplantation model6. PKCδi er normalt konjugeret med en celle-gennemtrængende peptid, TAT, intracellulære levering. Det har imidlertid vist sig, TAT peptid alene har ikke-specifikke biologiske effekter, herunder fremme af angiogenese, apoptose og hæmning af flere cytokiner9,10,11. Nanopartikler, små partikler spænder fra 1 til 100 nm i diameter12, har været undersøgt som kandidater i lette drug delivery13. Især betragtes guld nanopartikler (BNI) som noninvasive og ugiftige. Derfor har vi udviklet BNI som drug delivery luftfartsselskaber for peptid-baserede lægemidler14,15.
Overfladen af BNI kan manipuleres til specifikke applikationer såsom molekylære anerkendelse16,17, kemiske sensing18, imaging19og medicinafgivelse. En GNP/peptid hybridsystem er blevet udviklet, som indeholder 20 nm BNI og to korte peptider (P2: CAAAAE og P4: CAAAAW) på et 95:5 forhold, til at redigere egenskaberne overflade af BNI. P2 peptid, med de negativt ladede glutaminsyre (E) i slutningen, stabiliserer BNI i en vandig opløsning, og P4 peptid, med de hydrofobe tryptophan (W) i slutningen, hjælper BNI indgangen til celler14. Cystein (C) rester fra N endepunktet for disse peptider indeholder en thiol gruppe, der kan konjugat til guld overflader14. Dette peptid/GNP hybrid blev yderligere brugt til at levere PKCδi (CSFNSYELGSL). Optimeret kindtand forholdet mellem P2:P4 til PKCδi er 47.5:2.5:50. BNI konjugeret med PKCδi (GNP/PKCi) er stabil i destilleret vand, 0,9% NaCl og PBS, som indeholder bovin albumin eller føtal bovint serum14. Intravenøs injektion af GNP/PKCi har vist sig at forhindre iskæmi-reperfusion skade af lunge15. Denne artikel beskriver en metode til at formulere GNP/PKCi og beskriver hvordan man kan evaluere de fysisk-kemiske egenskaber af GNP/PKCi. Vi har brugt lignende metoder til at formulere andre peptid-baserede lægemidler konjugeret til GNP20,21,22. Vi håber, denne artikel vil drage mere opmærksomhed på denne nye formulering for intracellulære medicinafgivelse.
For at sikre korrekt formulering, er det afgørende, at δPKCi løsningen gennemgår sonikering trin skitseret i 1,6. ΔPKCi peptid sekvensen indeholder hydrofobe fraspaltning, så en sonikator hjælper med at opløse PKCi i 50% acetonitril løsning. Derudover er det meget vigtigt at blande opløsningsmiddel omhyggeligt, som beskrevet i trin 2.7. GNP/PKCi hybrid vil ikke formuleres godt, hvis disse trin ikke er udført korrekt, på grund af sammenlægning af δPKCi peptid23.
BNI-drug f…
The authors have nothing to disclose.
Dette arbejde støttes af forskningstilskud fra canadiske institutter for sundhedsforskning (PJT-148847), Ministeriet for forskning og Innovation i Ontario (RE-08-029) og Canada første forskning af topkvalitet Program, medicin ved Design på University of Toronto. Dr. Mingyao Liu er James og Mary Davie stol i lunge skade, reparation og Regeneration.
negatively charged glutamic acid peptide (P2) | CanPeptide | Sequence: CAAAAE-NH2 Length: 6aa Modification: C-terminal amidation Quantity: 50mg Purity: >95% |
|
hydrophobic tryptophan peptide (P4) | CanPeptide | Sequence: CAAAAW-NH2 Length: 6aa Modification: C-terminal amidation Quantity: 50mg Purity: >95% |
|
δPKCi peptide | CanPeptide | Seqeuence: CSFNSYELGSL-NH2 Length: 11aa Modification: C-terminal amidation Quantity: 50mg Purity: >95% |
|
Conical tube(50ml) | Corning Life Sciences | 3582070 | |
Conical tube(15ml) | Corning Life Sciences | 3582096 | |
Acetonitrile | Sigma-Aldrich | 271004-100ML | |
Sonicator | Branson Ultrasonics Corp. | Branson 2510MTH | |
Microtube | Diamed.ca | AD 150-N | |
Gold nanoparticle solution | Ted Pella | 15705-5 | A particle size is 20nm |
Rocking Platform shaker | VWR international | 40000-304 | |
Microcentrifuge | Eppendorf | 5417R | |
Acryl cuvette | SARSREDT | 67.758 | |
UV-Vis spectrophotometer | Agilent | Caty 60 UV-Vis |