Vi har brukt en gull hydrogenion peptid hybrid intravenøst levere en syntetisk peptid, protein kinase C-deltaet inhibitor, som redusert ischemia-reperfusion-indusert akutt lungen skade. Her viser vi detaljerte protokollen for drug formulering. Andre intracellulær peptider kan utformes på samme måte.
Protein kinase C-deltaet hemmer (PKCδi) er en lovende stoffet å hindre ischemia-reperfusion-indusert orgel skade. Det er vanligvis konjugert til en celle-gjennomtrengende peptid, TAT, intracellulær levering. TAT har imidlertid vist uspesifisert biologiske aktiviteter. Gull nanopartikler (GNPs) kan brukes som stoffet levering bærer uten anerkjent toksisitet. Derfor har vi brukt en GNP/peptid hybrid for å levere PKCδi. To korte peptider (P2: CAAAAE og P4: CAAAAW), i 95:5 forholdet, ble brukt til å endre egenskapene overflaten av BNP. GNPs konjugert med PKCδi (GNP/PKCi) er stabile i destillert vann, 0,9% NaCl og fosfat-bufret saltvann (PBS) som inneholder bovin serum albumin eller fosterets bovin serum. Intravenøs injeksjon av GNP-PKCi ble tidligere vist å hindre ischemia-reperfusion skade av lunge. Denne artikkelen beskriver en protokoll for å formulere GNP/PKCi og vurdere physiochemical egenskapene til GNP/PKCi. Vi har brukt lignende metoder for å formulere andre peptid-baserte stoffer med GNP. Denne artikkelen vil forhåpentligvis trekke mer oppmerksomhet til denne romanen intracellulær stoffet levering teknologi og dens anvendelser i vivo.
Lungetransplantasjon lagrer pasienter med sluttstadiet lunge sykdom1. Alvorlige komplikasjoner etter lungetransplantasjon beholdes imidlertid en hindring. I de tidlige fasene etter lungetransplantasjon, primære pode dysfunksjon er den mest skadelige komplikasjoner1, og dens primære årsaken er ischemia-reperfusion (IR)-indusert akutt lungen skade2.
Under kalde bevaring er metabolisme i en donor lunge begrenset til et svært lavt nivå. Imidlertid er reaktive oksygen arter og nitrogenoksid syntese aktivert på grunn av opphør av blod flyte3. Etter transplantasjon, blodsirkulasjonen er gjenopprettet og reaktive oksygen arter og nitrogenoksid genereres under kalde iskemi styrke betennelse og celle død, noe som resulterer i vev skade.
For å hindre IR skade, har en protein kinase Cδ hemmer (PKCδi) blitt brukt i hjertet, hjernen og lunge4,5,6,7,8. Disse studiene viste at PKCδi redusert betennelse og apoptose under reperfusion. Det har også hindret lunge IR skade i rotter og en lunge transplantasjon modell6. PKCδi er vanligvis konjugert med en celle-gjennomtrengende peptid, TAT, intracellulær levering. Det har imidlertid vist at TAT peptid alene har ikke-spesifikke biologiske effekter, inkludert markedsføring av angiogenese apoptose og hemming av flere cytokiner9,10,11. Nanopartikler, små partikler, fra 1 til 100 nm i diameter12, utforsket som kandidater i tilrettelegge stoffet levering13. Spesielt regnes gull nanopartikler (GNPs) som noninvasive og nontoxic. Derfor har vi utviklet GNPs som narkotika levering bærer for peptid-baserte narkotika14,15.
Overflaten av GNPs kan manipuleres for bestemte programmer som molekylær anerkjennelse16,17, kjemiske sensing18, tenkelig19og narkotika-leveranser. En GNP/peptid hybridsystem har blitt utviklet, som inneholder 20 nm GNPs og to korte peptider (P2: CAAAAE og P4: CAAAAW) i 95:5 forholdet, endre overflaten egenskapene for GNPs. P2 peptid, med den negativt ladde Glutaminsyre (E) på slutten, stabiliserer GNPs i en vandig løsning, og P4 peptid, med den hydrofobe tryptofan (W) på slutten, hjelper GNPs inngangen til celler14. Cystein (C) rester endestasjonen N til disse peptider inneholder en thiol gruppe som kan bøye gull overflater14. Dette peptid/GNP hybrid ble videre brukt til å levere PKCδi (CSFNSYELGSL). Optimalisert molar forholdet mellom P2:P4 til PKCδi er 47.5:2.5:50. GNPs konjugert med PKCδi (GNP/PKCi) er stabil i destillert vann, 0,9% NaCl og PBS med bovin albumin eller fosterets bovin serum14. Intravenøs injeksjon av GNP/PKCi har vist å hindre ischemia-reperfusion skade av lunge15. Denne artikkelen beskriver en metode for å formulere GNP/PKCi og beskriver hvordan man skal vurdere mekanisk-egenskapene for GNP/PKCi. Vi har brukt lignende metoder for å formulere andre peptid-baserte stoffer konjugert GNP20,21,22. Vi håper denne artikkelen vil trekke mer oppmerksomhet til denne romanen formulering intracellulær stoffet levering.
For å sikre riktig formulering, er det avgjørende at den δPKCi løsningen gjennomgår sonication trinnet i 1.6. ΔPKCi peptid sekvensen inneholder hydrofobe moieties, så en sonicator bistår i oppløsning PKCi i 50% acetonitrile løsningen. I tillegg er det svært viktig å blande løsemiddelet omhyggelig, som beskrevet i trinn 2.7. GNP/PKCi hybrid vil ikke også være formulert hvis disse trinnene ikke gjort riktig, på grunn av aggregering av δPKCi peptid23.
GNP-baserte drug for…
The authors have nothing to disclose.
Dette arbeidet er støttet av forskningsmidler fra kanadiske institutter for helseforskning (PJT-148847), departementet for forskning og innovasjon i Ontario (RE-08-029) og Canada første av fortreffelighet forskningsprogram, medisin ved Design ved University of Toronto. Dr. Mingyao Liu er James og Mary Davie stol i lungen skade, reparasjon og gjenfødelse.
negatively charged glutamic acid peptide (P2) | CanPeptide | Sequence: CAAAAE-NH2 Length: 6aa Modification: C-terminal amidation Quantity: 50mg Purity: >95% |
|
hydrophobic tryptophan peptide (P4) | CanPeptide | Sequence: CAAAAW-NH2 Length: 6aa Modification: C-terminal amidation Quantity: 50mg Purity: >95% |
|
δPKCi peptide | CanPeptide | Seqeuence: CSFNSYELGSL-NH2 Length: 11aa Modification: C-terminal amidation Quantity: 50mg Purity: >95% |
|
Conical tube(50ml) | Corning Life Sciences | 3582070 | |
Conical tube(15ml) | Corning Life Sciences | 3582096 | |
Acetonitrile | Sigma-Aldrich | 271004-100ML | |
Sonicator | Branson Ultrasonics Corp. | Branson 2510MTH | |
Microtube | Diamed.ca | AD 150-N | |
Gold nanoparticle solution | Ted Pella | 15705-5 | A particle size is 20nm |
Rocking Platform shaker | VWR international | 40000-304 | |
Microcentrifuge | Eppendorf | 5417R | |
Acryl cuvette | SARSREDT | 67.758 | |
UV-Vis spectrophotometer | Agilent | Caty 60 UV-Vis |