Motivi di DNA stabile, 1D e 2D nanostrutture costruito da molecole di DNA circolare piccola
Summary
Questo articolo presenta un protocollo dettagliato per la legatura di T4 e denaturazione pagina purificazione di piccole molecole di DNA circolare, ricottura e nativo pagina analisi circolare piastrelle, montaggio e formazione immagine AFM di nanostrutture di DNA 1D e 2D, nonché dell’agarosi gel purificazione di elettroforesi e centrifugazione di nanostrutture di DNA finiti.
Abstract
Questo articolo presenta un protocollo dettagliato per la sintesi di piccole molecole di DNA circolare, ricottura di motivi di DNA circolare e la costruzione di nanostrutture di DNA 1D e 2D. Nel corso di decenni, il rapido sviluppo della nanotecnologia del DNA è attribuito all’uso di DNAs lineare come i materiali di origine. Ad esempio, le mattonelle DAO (double crossover, curve a metà in antiparallelo, dispari) sono ben nota come un blocco di costruzione per la costruzione delle grate del DNA 2D; la struttura di base di DAO è fatto da due oligonucleotidi lineare singolo filamento (ss), come due corde facendo un nodo di nonna di mano destra. Qui, un nuovo tipo di piastrelle di DNA chiamato cDAO (accoppiato DAO) sono costruiti utilizzando un piccolo ss-DNA circolare di c64nt o c84nt (circolare 64 o 84 nucleotidi) come filo del patibolo e diversi ss-DNAs lineare come i fili dei punti metallici. Perfetti nanostrutture 1D e 2D sono assemblati da cDAO piastrelle: nanospirals, nanotubi, nanofili infinito, nanonastri; e nano-rettangoli finiti. Protocolli dettagliati sono descritti: 1) preparazione di ligasi T4 e purificazione denaturando pagina (elettroforesi del gel di poliacrilammide) di piccoli oligonucleotidi circolare, 2) ricottura di piastrelle circolare stabile, seguita dall’analisi di pagina nativo, 3) montaggio di infinito 1D nanofili, nanorings, nanospirals, reticoli 2D infiniti di nanotubi e nanonastri e finiti 2D nano-rettangoli, seguita da formazione immagine AFM (microscopia a forza atomica). Il metodo è semplice, robusto e conveniente per la maggior parte dei laboratori.
Introduction
Molecole di DNA sono stati usati per costruire molti generi di nanostrutture nei decenni. Motivi tipici includono DAE (doppio crossover, antiparallelo, anche metà-giri) e DAO piastrelle1,2,3, piastrelle stelle4,5,6,7, singolo incagliato (ss) piastrelle8,9,10e DNA origami11,12,13. Questi motivi di DNA e le grate sono assemblate da ss-DNAs lineare. Recentemente, gli altri e noi abbiamo segnalato l’uso di circolare ss-oligonucleotidi come scaffold per creare motivi, nanotubi 1D e 2D grate14,15,16,17. Inserendo un Holliday junction (HJ)18,19,20,21 presso il centro di c64nt, una coppia di due accoppiati DAO tessere può essere formata17. Questo nuovo motivo di cDAO e suoi derivati sono stabili e sufficientemente rigida da assemblare 2D DNA grate fino a 3 × 5 µm2. In questa carta, usiamo un termine “piastrella circolare”, che è definito come una molecola di complessi del DNA stabile costruita con una impalcatura circolare e le altre graffette lineare di ss-oligonucleotidi, e un altro termine di “piastrella lineare”, che è costruito da una serie completa di lineare SS-oligonucleotidi.
Questo protocollo viene illustrato come costruire cinque tipi di nanostrutture di DNA con piccole molecole di DNA circolare come impalcature: 1) infinito nanofili di c64nt e c84nt 1D, 2D cDAO-c64nt-O 2) infinito e cDAO-c64nt-E (-O rappresenta un numero dispari di 5 curve a metà e -E rappresenta un numero pari di 4 metà-giri) reticoli, 3) infinite 2D cDAO-c84nt-O ed cDAO-c84nt-E grate, 4) finiti 2D 5 × 6 cDAO-c64nt-O e 5 × 6 cDAO-c74 & 84nt-O rettangoli, 5) infinito 1 D acDAO-c64nt-E nanorings e nanospirals (si prega di fare riferimento a Figura 3-5 per i disegni schematici e le immagini di cui sopra cinque generi di nanostrutture di DNA). I nanofili di 1D c64nt e c84nt vengono assemblati da ogni c64nt e c84nt dell’impalcatura associato rispettivamente due graffette lineare. Ogni piastrella circolare di cDAO-c64nt, acDAO-c64nt, cDAO-c74nt o cDAO-c84nt è temprata dal suo patibolo corrispondente di c64nt, c74nt o c84nt con quattro graffette lineare rispettivamente. I reticoli 2D infiniti sono assemblati con lo stesso tipo di due piastrelle circolari con sequenze diverse. I due reticoli finiti rettangolo 2D sono assemblati da due set di Sub-tessere circolare 32 rispettivamente. Per risparmiare soldi, c84nt, c74nt e c64nt solo uno-sequenziato viene utilizzato come patibolo rispettivo mentre sporgenze differenti sono usati per temprare il 32 cDAO-c64nt, 12 cDAO-c74nt e 20 cDAO-c84nt circolare Sub-piastrelle rispettivamente nel primo passaggio ricottura Sub-tile, quindi mescolare le sub-tessere circolare 32 corrispondenti e applicare il reticolo secondo ricottura passo per assemblare il cDAO finiti 5 × 6-c64nt-O e 5 × 6 cDAO-c74 & 84nt-O le grate, rispettivamente. Sicuramente, diversamente-sequenziato circolare ponteggi possono essere adottati per assemblare una varietà di nanostrutture di dimensioni finite, tuttavia vi costerà più soldi e fatiche. L’infinito 1D acDAO-c64nt-E nanorings e nanospirals vengono ricotti da uno-sequenziato asimmetrica acDAO-c64nt piastrelle con connessioni lineare di un numero pari di 4 metà-giri. Esistono due approcci per assemblare le grate 2D infinite da circolare piastrelle di cDAO-c64nt e cDAO-c84nt, che si distinguono per le distanze intertile di un numero pari di 4 e un numero dispari di 5 metà-giri rispettivamente. Il primo richiede tutte le tessere per essere allineati in modo identico; quest’ultimo richiede alternanza delle facce di due tessere adiacenti lungo gli assi elicoidali. Se la piastrella è rigida e piana, ad esempio cDAO-c64nt, entrambi gli approcci genererà nanonastri planare; Se la piastrella è curvo verso una direzione, ad esempio cDAO-c84nt, la intertile connessione di un numero pari di 4 giri mezza genereranno nanotubi, mentre la connessione intertile di un numero dispari di 5 giri mezzo produrrà planare nanonastri dovuto l’eliminazione di curvatura-biased crescita di allineamento alternativo di tegole curve. Il corretto montaggio di nanostrutture di DNA 1D e 2D da piastrelle circolare indica diversi vantaggi di questo nuovo approccio: applicate come stabilità e rigidità della circolare piastrelle sopra le mattonelle lineare, piastrelle chirali per assemblaggio di nanostrutture asimmetrico nanorings e nanonastri, nuove visioni sulla comprensione della meccanica del DNA e strutture molecolari, ecc.
Protocol
Representative Results
Discussion
I protocolli presentati in questo focus articolo sulla sintesi di piccole molecole di DNA circolare e l’assemblaggio di nanostrutture di DNA. La maggior parte dei disegni di DNA sequenziati in modo casuale può essere utilizzata in questo protocollo. La purezza di DNAs circolare è critica per il successo delle assemblee del DNA. Il rendimento di produzione di ciclizzazione può essere migliorato abbassando la concentrazione di DNA lineare 5′-fosforilato; Tuttavia, questo aumenterà il carico di lavoro per produrre la st…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Siamo grati per il sostegno finanziario da NSFC (sovvenzioni n. 91753134 e 21571100) e lo stato chiave laboratorio di Bioelettronica di Southeast University.
Materials
| T4 ligase | TaKaRa | 2011A | |
| T4 buffer | TaKaRa | 2011A | |
| TE buffer | Sangon | B548106 | |
| Thermo bottle | Thermos | SK-3000 | |
| Thermo cycler | Bio Gener | GE4852T | |
| Exonuclease I | TaKaRa | 2650A | |
| Exonuclease I buffer | TaKaRa | 2650A | |
| 30% (w/v) Acryl/Bis solution (19:1) | Sangon | B546016 | |
| TAE premix podwer | Sangon | B540023 | |
| Mg(Ac)2·4H2O | Nanjing Chemical Reagent | C0190550223 | |
| Urea | Sangon | A510907 | |
| TEMED | BBI | A100761 | |
| Ammonium Persulfate | Nanjing Chemical Reagent | 13041920295 | |
| Power supply | Beijing Liuyi | DYY-8C | |
| Water bath | Sumsung | DK-S12 | |
| Formamide | BBI | A100314 | |
| DNA Marker (25~500 bp) | Sangon | B600303 | |
| DNA Marker (100~3000 bp) | Sangon | B500347 | |
| Loading buffer | Sangon | B548313 | |
| PAGE electrophoresis systerm | Beijing Liuyi | 24DN | |
| Filter | ASD | 5010-2225 | 0.22 µM |
| UV imaging System | Tanon | 2500R | |
| n-butanol | Sangon | A501800 | |
| Absolute Ethanol | SCR | 10009257 | |
| NaOAc | Nanjing Chemical Reagent | 12032610459 | |
| Centrifuge | eppendorf | Centrifuge 5424R | |
| Vacuum concentrator | CHRIST | RVC 2-18 | |
| Ultraviolet spectrum | Allsheng | Nano-100 | |
| nucleic acid stain | Biotium | 16G1010 | GelRed |
| Agarose | Biowest | G-10 | |
| Agarose electrophoresis systerm | Beijing Liuyi | DYCP-31CN | |
| Heating Plate | Jiangsu Jintan | DB-1 | |
| TBE premix podwer | Sangon | B540024 | |
| filter column | Bio-Rad | 7326165 | Freeze 'N Squeeze column |
| AFM | Bruker | Dimension FastScan | |
| PEG8000 | BBI | A100159 | |
| Mica | Ted Pella | BP50 | |
| triangular AFM probe in air | Bruker | FastScan-C | |
| triangular AFM probe in fulid | Bruker | ScanAsyst-fluid+ | |
| DNA strands | Sangon |
Riferimenti
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