Introduserer vi en ny arbeidsflyt for elektronmikroskop undersøkelser av hjernevev. Metoden tillater brukeren å undersøke neuronal funksjoner på en objektiv måte. For grunnleggende analyse presenterer vi også et skript som automatisk de fleste av arbeidsflyten for randomisert prøvetaking.
Undersøkelser av ultrastructural funksjoner av nevroner og deres synapser er bare mulig med elektronmikroskop. Spesielt for komparative studier av endringene i tettheter og distribusjoner av slike funksjoner er en upartisk prøvetaking protokoll avgjørende for pålitelige resultater. Her presenterer vi en arbeidsflyt for bildeopptak av hjernen prøver. Arbeidsflyten kan systematisk uniform stikkprøvekontroll innenfor et definert hjernen område, og bildene kan analyseres ved hjelp av en disector. Denne teknikken er mye raskere enn omfattende undersøkelse av seriell deler, men fortsatt presenterer en mulig tilnærming for å beregne tettheter og distribusjoner ultrastructure funksjoner. Før embedding, ble farget vibratome deler brukt som referanse for å identifisere hjernen regionen under etterforskning, som hjalp fremskynde samlede prøven utarbeidelsen prosessen. Denne tilnærmingen ble brukt komparative studier undersøke effekten av en beriket-bolig miljøet på flere ultrastructural parametere i musen hjernen. Basert på vellykket bruk av arbeidsflyten, tilpasset vi det for grunnleggende analyse av hjernen prøver. Vi optimalisert protokollen i form av bruker-interaksjon. Automatisere alle tidkrevende skritt ved å samle et skript for åpen kildekode-programvare SerialEM hjelper brukeren å fokusere på det viktigste arbeidet for grunnleggende kart. Som opprinnelige arbeidsflyten betalt vi oppmerksomhet til upartisk prøvetaking tilnærming garantere pålitelige resultater.
I elektronmikroskop er det ofte utfordrende å prøve representative områdene i delene. Vi, partisk som observatør, ofte for å se på bestemte områder trukket oppmerksomme av iøynefallende funksjoner av prøven, hindre et godt fordelt, upartiske utvalg. Prøvetaking skjevhet kan bare unngås hvis alle deler av regionen rundt får samme mulighet for å havne i en elektron mikroskop-bilde1. Det er mulig å unngå prøvetaking bias uten en programvareløsning, for eksempel ved å trykke styrekulen av mikroskopet manuelt uten å se på bildet, slik som å velge prøvetaking regioner hvor scenen stopper. Men dette er strengt tatt ikke en tilfeldig prosedyre, fordi, bevisst eller ubevisst, brukeren kan ha innflytelse på bevegelsen av scenen, og videre, dette er ikke en sofistikert måte for å velge prøvetaking regioner. Stikkprøvekontroll blir spesielt viktig hvis parene deler brukes til å vurdere hvor mange strukturer i et bestemt volum, for eksempel for stereology1, som krever par seksjoner, en kjent avstand. Det vil også være mulig å se bare på ett enkelt avsnitt og beregne antall spesifikke strukturer2, men med denne tilnærmingen etterforskere pleier å overvurdere numeriske tettheten av større strukturer, med mindre strukturer er svært små i sammenligning til snittykkelsen. Alternative tilnærminger er å rekonstruere volumer av føljetong deler og dermed få ønskede data3. Men dette er svært tidkrevende og ikke en mulig tilnærming for (større) komparative studier.
For å overvinne disse problemene, har vi utviklet en arbeidsflyt som gjør forskeren automatisk velge eksempler for å få elektron micrographs til regelmessig mellomrom i ultra tynne snitt. De elektron micrographs er tilfeldig, slik at upartiske prøvetaking. Tilnærmingen er egnet både for å fastslå numeriske tettheter av strukturer (for eksempel synapser innenfor et bestemt neuropil volum4,5), og dimensjonene på strukturelle funksjoner (for eksempel bredden på den synaptiske kløften, eller diameteren til postsynaptic tetthet4,5).
Arbeidsflyten bruker en skreddersydd tilfeldig punkt prøvetaking (RPS) programvare (skrevet i Java script bruker skripting-programvaren som følger med vår mikroskop) som automatisk beregner rutenettet stillinger innenfor et forhåndsdefinert område av interesse i en ultratynn del. RPS programvaren flytter scenen av elektronmikroskop til disse forhåndsdefinerte poeng, slik at et elektron mikroskop-bilde gjøres på hvert punkt. Først definerer du et område av interesse i delen tynn. Deretter beregner programmet RPS rutenettet stillinger i denne regionen. X / y koordinatene til første posisjon opprettes tilfeldig, og de gjenværende stillingene er plassert på regulært rutenett intervaller i forhold til første posisjon. Fordi alle deler av regionen rundt har samme sjanse til undersøkt, gir dette minimalt datainnsamling. Denne tilnærmingen av prøvetaking kalles også systematisk uniform stikkprøvekontroll (se referanser6,7 for mer informasjon).
For å bestemme de numeriske tettheter av strukturer, arbeider vi med parene deler som er en kjent avstand. Etter innhente et elektron mikroskop-bilde fra den første delen i en av de forutbestemte stillingene, flyttes TEM føljetong delen programvare (del av programvarepakken leveres med våre elektronmikroskop) til et tilsvarende punkt i den andre delen, for å få et elektron mikroskop-bilde av den tilsvarende plasseringen. Dette gjentas for hver plassering i forhåndsbestemte rutenettet. I vår tilnærming, en disector til å telle antall partikler i hvert par av elektron micrographs8,9. En disector består av et par counting rammer, én for hvert avsnitt8,9. Numerisk tettheten av objekter bestemmes bare telle objekter vises på den første delen (eller referansedelen) men ikke på den andre delen (eller oppslag delen). Kan beregne de numeriske tettheter av objekter i en rask og effektiv måte8,9. I tillegg på enkelt deler, kan todimensjonal strukturfunksjonene måles.
Vi har brukt denne arbeidsflyten klarer å vurdere forskjeller i synapse tall prefiks mus utsatt for berike omgivelsene (EE) boliger forhold sammenlignet med standard miljø (SE) boliger forhold4,5, og også for å evaluere ultrastructural forskjellene mellom wild type (WT) mus og neuropeptide Y (NPY) KO mus holdt under SE og EE5. Målet vårt var å se spesielt på strukturelle funksjoner av neurons, som numeriske synaptic tetthet, lengdene av aktive sonen i tverrsnitt og postsynaptic tetthet, bredden på den synaptiske kløften og antall synaptic blemmer, for å vurdere endringer i neuronal tilkobling og aktivisering mellom forskjellige eksperimentelle forhold. I tillegg var vi interessert i numerisk tettheten av tett kjerner blemmer (DCV) i neurons å bestemme mengden av lagrede neuropeptides i et bestemt område i hjernen.
Basert på suksessen til vår tilnærming for studiene beskrevet ovenfor, i vår neste trinnet har vi tilpasset vår arbeidsflyt for å merke områder for upartiske elementær analyser i menneskelige hjerne prøver. Dette ble gjort til bildet jern, som er lagret i ferritin molekyler i både neurons og gliacellene. For dette samlet vi et skript som tillot oss å automatisere det meste av driften for en tilfeldig screening-prosess av hjernen inndelinger i et definert område.
Arbeidsflyten presenteres her gjør forskeren å få data om ultrastructural funksjoner på en objektiv måte. Dette er mye mindre tidkrevende enn volum undersøkelser fra føljetong deler. Flere forskjellige programmer brukes til å oppnå dette målet. Først brukes vår skreddersydde RPS -programvare (for detaljer om tilgjengelighet, vennligst kontakt tilsvarende forfatteren) til å introdusere en tilfeldig scenen-shift for å velge prøvetaking området koordinatene. Dette gir en systematisk uniform stikkprøvekontroll av Avkastningen. Deretter for telling av spesifikke strukturer, vi tilpasset metoden disector hvor 2 etterfølgende avsnittene med kjent distanse sammenlignes, i en ny måte i forhold til tidligere studier13,14,15 som vi brukte vår skreddersydd RPS programvare for systematisk uniform stikkprøvekontroll. Dette sparer tid i forhold til 3D-rekonstruere hele volumer fra føljetong deler. Skreddersydd RPS programvaren er spesielt utviklet for én type mikroskop som er en begrensende faktor for gjengivelse arbeidsflyten. Et alternativ fra denne bestemte programvare ville være et program som kan og er kompatibel med andre mikroskop modeller.
Vi benyttet ble denne tilnærmingen for våre komparative studier4,5. Ultra tynne snitt av neuronal vev, området av interesse ble skissert og bilder ble tatt av systematisk uniform stikkprøvekontroll innenfor dette området. Det må bemerkes at området av interesse, det polymorph laget av dentate gyrus, er et ganske lite område å undersøke som kan være gunstig for vår tilnærming. En tilfeldig plassert disector, vi vurdert antall DCV og flere ultrastructural funksjoner i synapser i DGpl av voksen mus ligger i SE og EE samt voksen WT mus versus voksen NPY knockout mus. De innsamlede dataene bruker vår tilnærming, og viste endringer i noen av parameterne undersøkt. Disse funnene bekreftet de fra andre lignende studier i juvenile dyr2.
En ulempe av eksperimentell bruk av arbeidsflyten kan være at denne multi-application-tilnærmingen ikke er ideell når det gjelder brukervennlighet, brukerne trenger å bli komfortabel med forskjellige brukergrensesnitt (i vårt tilfelle, brukergrensesnittet, TEM føljetong delen RPS programvaren og SerialEM programvare). Lære å håndtere alle programmer på en effektiv måte er tidkrevende og bør tas i betraktning. Investere tid i å lære å bruke denne arbeidsflyten er imidlertid fortsatt tydelig gunstige over tid som er nødvendig for å analysere hele volumer med føljetong delen TEM. Metoden med å bruke en disector plassert ved systematisk uniform stikkprøvekontroll i området rundt er tilstrekkelig å presentere pålitelige data1 uten behov for å undersøke en høy mengde deler/volum.
For å maksimere utfallet i våre studier, var det viktig å ta godt vare under eksempel forberedelse, som bevaring av vev og strukturer ikke er bare avgjørende for å vurdere strukturelle funksjoner, men også for å identifisere området av interesse entydig. En avgjørende faktor, og kanskje en annen ulempe med denne metoden er at det kreves høy kvalitet ultra tynne snitt parene: det må være noen hull eller rynker som dekker området under etterforskning i delene, og snittykkelsen må vedlikeholdt homogen. Forskeren må være godt trent på ultramicrotomy. Forsiktighet må også tas når imaging avsnittene i TEM, delene er følsomme for elektron strålen skade og kan lett rive fra hverandre. Videre er det viktig å velge riktig antall prøvetaking områder i Avkastningen. Avhengig av eksperimentelle målet har forstørrelsen av elektron micrographs angis nøye. For våre eksperimenter spesielt er teller synapser i sentralnervesystemet, 20 regioner av interesse på ett avsnitt med området 30.25 µm2 optimal. Det anbefales av personellet i erkjennelsen funksjonene i spørsmålet (i vårt tilfelle synapser, synaptic funksjoner og DCV) å få pålitelige resultater. Synaptiske blemmer må identifiseres for å identifisere synapser, og dette krever en oppløsning på minst 10 nm. For dette, en forstørrelse på 5000 X var optimal, men det må bemerkes at forstørrelsen avhengig av maskinvareparametere som typen og plasseringen av kameraer og måtte tilpasses for andre mikroskop og/eller kameraet. Det har også bemerkes at protokollen bruker programmer bestemt en TEM og at brukere med andre modeller må vurdere forskjellene i oppsettet.
Vi tror våre arbeidsflyt kan tilpasses for mange andre programmer ikke bare i nevrovitenskap, men i et bredt felt av biologiske vitenskap og materielle vitenskap (når den høye oppløsningen av en TEM er nødvendig) når problemstillingen krever en systematisk uniform tilfeldig prøvetaking og hvor å bli undersøkt ber om en tid effektiv måte analyse. For eksempel er vi for tiden interessert i å lokalisere jern-butikker i den menneskelige hjernen. For dette, har vi nylig tilpasset våre arbeidsflyten, slik at grunnleggende analyse på ultra tynne snitt i tilfeldig valgt områder. For å redusere antallet programmer som er nødvendig for arbeidsflyten, har vi som mål å bruke ved hjelp av SerialEM programvare, fordi det kan programmeres til å flytte scenen til forhåndsinnstilt som kan velges på en tilfeldig måte. Vi opprettet tilpassede skript for å kontrollere TEM, med sikte på automatizing arbeidsflyten helt. Dette viste seg mulig bortsett fra autofokusering i filtrert tenkelig modus, som ikke gir tilfredsstillende resultater. Vi brukte dermed DM programvare for fokusering og for å få energi-filtrert bilder.
I sammendraget presenterer vi programvareløsninger som hjelper i å skaffe elektron micrographs på en objektiv måte.
The authors have nothing to disclose.
Finansiert av prosjektnummeret østerrikske Science fondet, FWF, P 29370 B27
Pentobarbital | SigmaAldrich | P3761 | |
Formaldehyde | Merck | 1040051000 | 1kg |
Glutardialdehyde | Science Services | E 16210 | 25%; 100ml; EM grade |
cacodylate buffer | Merck | C4945 | 250g; Dimethylarsinic acid sodium trihydrate |
Thionine acetate/Ceristain | Merck | 861340 | |
acetic acid | Merck | 1000631000 | 1 L |
Sodium hydroxide | Merck | 1064951000 | 1 kg, pellets |
osmium tetraoxide | Science Services | E 19110 | 10x1g |
TAAB embedding resin | Science Services | TAT001 | 500g |
DMP-30 | Science Services | TAD024 | 100g |
DDSA | Science Services | TAD025 | 500g |
Uranyl acetate dihydrate | Plano GmbH | 19481 | depleted, 25g |
Ultrastain 2 | Leica | 16707235 | Lead citrate |
Toluidine blue solution | Agar Scientific | AGR1727 | 10g |
Pioloform | Plano GmbH | R1275 | 10g Powder |
Proylenoxide | SigmaAldrich | 82320-1L | 1L |
DPX embedding medium | Plano GmbH | R1320 | embedding medium for semi-thin sections on glass slide, 50 ml |
Vibratome, Leica VT 1000 | Leica Microsystems, Vienna, Austria | ||
Leica Ultracut UCT, ultramicrotom | Leica Microsystems, Wetzlar, Germany | ||
Tecnai G2 20 | FEI,Eindhoven, Netherlands | ||
Megaview wide angle camera | Olympus Soft Imaging Solution, Münster, Germany | ||
US 1000 digital camera | Gatan, Pleasanton, USA | ||
TEM Imaging Analysis Software | FEI,Eindhoven, Netherlands | ||
FEI Serial Section Software | FEI,Eindhoven, Netherlands | ||
Fiji, ImageJ 1.52e | National Institute of Health, USA | ||
SPSS 20.0 | SPSS Inc., Chicago, IL, USA | ||
SerialEM | Regents of the University of Colorado | ||
RPS (random point sampling) software 0.9a | custom-made | ||
Disector v1.0.2 (ImageJ macro) | custom-made | ||
EFTEMSerialEM (SerialEM script) | custom-made |