Uso de Ustilago maydis como un caballo de Troya en Situ entrega de maíz las proteínas
Summary
Este trabajo describe la clonación de una cepa de caballo de Troya de Ustilago maydis para la entrega in situ de proteínas secretadas de maíz en tres tipos diferentes de tejidos de maíz.
Abstract
Inspirado en el mito de caballo Trojan Homer´s, hemos diseñado el patógeno del maíz Ustilago maydis para proporcionar proteínas secretadas en el apoplasto maíz permitiendo análisis fenotípico en vivo. Este método no se basa en la transformación de maíz pero explota capacidades secretoras de patógenos y genética microbiana. En este documento, permite la inspección de en vivo entrega proteínas secretadas con alta resolución espaciotemporal en diferentes tipos de sitios de infección y los tejidos. La estrategia del caballo de Troya puede ser utilizada para complementar transitorio maíz fenotipos de pérdida de función, para caracterizar funcionalmente dominios de la proteína, para analizar los efectos de la proteína objetivo, o para el estudio de sobredosificación de proteína juego, convirtiéndolo en una poderosa herramienta estudios de la proteína en el sistema de cultivo de maíz. Este trabajo contiene un protocolo preciso sobre cómo generar una cepa de caballo de Troya seguida por protocolos estandarizados infección aplicar este método a tres tipos de tejido diferentes de maíz.
Introduction
El patógeno foliares Ustilago maydis es el agente causativo del maíz smut enfermedad1. Infecta todas las partes aéreas de maíz resultando en tumores grandes que contienen esporas de melanized, negro. A nivel mundial, se estima en U. maydis causa una pérdida anual de alrededor del 2% de la producción de maíz, mientras que los tumores son apreciados como un manjar gastronómico en México. Infección de la planta se inicia por un apresorio que secreta enzimas lisis celular para penetrar la primera capa de células epidérmicas maíz. De un sitio de infección primaria, U. maydis crece intracelularmente e intracelular, invaden células de uno o dos capas cada día1,2. Resultado exitoso de la infección en hipertrofia de planta que se transforma en tumores visibles en cinco días post infección1,3,4. Durante todas las etapas de la infección, los hyphae fungicidas invaginate la membrana de citoplasma de la planta sin contacto directo con el citoplasma host1,2. El espacio apoplasmic apretado entre la hifa infectante y la membrana de plasma de la planta se considera que el sitio interactivo de host/patógeno, llamado la zona de interacción de foliares. Para superar el sistema inmune innato de planta, U. maydis secretan una matriz de proteínas efectoras en foliares interacción zona1. Algunos efectores son tomados por células de la planta, mientras que otros permanecen en los foliares interacción zona5,6,7,8. Efectores apoplásticos uno es UmPit2, que interactúa con las proteasas apoplastic maíz para prevenir la liberación de la señalización del péptido ZmZIP1 de ZmPROZIP por apoplasto proteasa actividad9,10.
En las últimas décadas, U. maydis se convirtió no sólo un modelo para la genética fúngica en la interacción planta-patógeno, sino también una valiosa herramienta en la biotecnología debido a un ciclo de vida bien comprendido, fácil accesibilidad genética y expresión heteróloga de secretada proteínas11,12,13. Señales para la secreción de ambas proteínas convencionales y no convencionales se han determinado lo que permite el control de modificaciones del posttranslational14. Recientemente, U. maydis fue empleado como una herramienta de caballo de Troya para estudiar pequeños, secretan proteínas maíz en situ15. El enfoque de caballo de Troya fue utilizado con éxito para analizar la función de la proteína secretada, pequeñas ZmMAC1 que participa en el desarrollo de la antera. ZmMAC1 induce la división periclinal de las células pluripotentes y especificación de destino celular de las células recién formado15. Por el mismo método, la función biológica del péptido asociado daño maíz ZmZIP1 fue revelada. U. maydis secretando el maíz A que zmzip1 dio lugar problemas de formación de tumor10. Por lo tanto, el caballo de Troya enfoque representa una valiosa alternativa a la proteína los estudios ines situ de alta resolución espaciotemporal que ni requieren generación de líneas de transformación de maíz estable ni infiltración de tejidos con heterologously proteínas expresadas y purificadas. En particular, la estrategia del caballo de Troya permite la secreción de cualquier proteína heteróloga en el apoplasto de maíz y comparación directa de infectados frente a células no infectadas de la planta dentro del mismo tejido.
Este protocolo muestra los pasos principales para la generación de una cepa de caballo de Troya de U. maydis para estudiar una proteína de interés. Además incluye información precisa sobre los procedimientos de la infección de tres tipos de tejido diferentes de maíz (hojas adultas, borlas y orejas) con U. maydis, que es un requisito previo para el estudio de la función de progreso y el proteínas infección espaciotemporal en estos tejidos diana. Otras especificaciones no son dadas en la amplificación del gen maíz y microscópica imagen técnicas, puesto que estos pasos son específicos del destino y dependiente del instrumento. Así, este protocolo está dirigido a usuarios avanzados de técnicas de biología molecular estándar.
Protocol
Representative Results
Discussion
Investigación de cultivo moderno exige protocolos de análisis molecular en genética y niveles de la proteína. Accesibilidad genética a través de transformación no es disponible o ineficientes y lentos para más especies de cultivos como el maíz. Por otra parte, herramientas genéticas confiables tales como sistemas de reportero promotor son escasos, lo que hace difícil para el estudio de la función de la proteína in situ de alta resolución espaciotemporal en sitios tisulares distintos. Apoplasto prot…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Los autores desean agradecer a Thomas Dresselhaus, Martin Parniske, Noureddine Djella y Armin Hildebrand para proporcionar espacio y planta el material de laboratorio. La obra original en el método del caballo de Troya fue apoyada por una beca postdoctoral de Leopoldina y proyecto NSF IOS13 39229. El trabajo presentado en este artículo fue apoyado por SFB924 (proyectos A14 B14) del DFG.
Materials
| 2 mL syringe | B. Braun | 4606027V | |
| 23G x 1 1/4 hypodermic needle | B. Braun | 4657640 | |
| Bacto Peptone | BD | 211677 | |
| cDNA from maize | from maize tissue expressing the gene of interrest | ||
| Charcoal | Sigma-Aldrich | 05105 | |
| Confocal laser scanning microscope | use locally available equipment | ||
| Cuvette (10 x 4 x 45 mm) | Sarstedt | 67742 | |
| Incubator-shaker set to 28 °C, 200 rpm | use locally available equipment | ||
| Light microscope with 400-fold magnification | use locally available equipment | ||
| Nco I | NEB | R0193 | |
| p123-PUmpit2-SpUmpit2-Zmmac1–mCherry-Ha | please contact the corresponding author | ||
| Pasteur pipet (glass, long tip) | VWR | 14673-043 | |
| pCR-Blunt-II-TOPO | Thermo Fisher Scientific | K280002 | can be exchanged for other basic cloning vectors like pENTR or pJET |
| Potato Dextrose Agar | VWR | 90000-745 | |
| Sharpie pen | use locally available equipment | ||
| Spectrophotometer | use locally available equipment | ||
| Ssp I | NEB | R0132 | |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S0389 | |
| T4 DNA ligase | NEB | M0202 | |
| TRIS | Sigma-Aldrich | TRIS-RO | |
| Xba I | NEB | R0145 | |
| Yeast extract | BD | 212750 |
Riferimenti
- Kämper, J., et al. Insights from the genome of the biotrophic fungal plant pathogen Ustilago maydis. Nature. 444, 97-101 (2006).
- Doehlemann, G., et al. Establishment of compatibility in the Ustilago maydis/maize pathosystem. Journal of Plant Physiology. 165, 29-40 (2008).
- Matei, A., et al. How to make a tumour: cell type specific dissection of Ustilago maydis-induced tumour development in maize leaves. New Phytologist. , (2018).
- Doehlemann, G., et al. Reprogramming a maize plant: transcriptional and metabolic changes induced by the fungal biotroph Ustilago maydis. The Plant Journal. 56, 181-195 (2008).
- Doehlemann, G., et al. Pep1, a secreted effector protein of Ustilago maydis., is required for successful invasion of plant cells. PLOS Pathogens. 5, e1000290 (2009).
- Redkar, A., et al. A secreted effector protein of Ustilago maydis guides maize leaf cells to form tumors. The Plant Cell. 27, 1332-1351 (2015).
- Djamei, A., et al. Metabolic priming by a secreted fungal effector. Nature. 478, 395-398 (2011).
- Tanaka, S., et al. A secreted Ustilago maydis effector promotes virulence by targeting anthocyanin biosynthesis in maize. eLife. 3, e01355 (2014).
- Mueller, A. N., Ziemann, S., Treitschke, S., Assmann, D., Doehlemann, G. Compatibility in the Ustilago maydis-maize interaction requires inhibition of host cysteine proteases by the fungal effector Pit2. PLOS Pathogens. 9, e1003177 (2013).
- Ziemann, S., et al. An apoplastic peptide activates salicylic acid signalling in maize. Nature Plants. 4, 172-180 (2018).
- Juárez-Montiel, M., et al. The corn smut (‘Huitlacoche’) as a new platform for oral vaccines. PLoS One. 10, e0133535 (2015).
- Sarkari, P., Feldbrügge, M., Schipper, K., Schmoll, M., Dattenböck, C. . Gene Expression Systems in Fungi: Advancements and Applications. , 183-200 (2016).
- Monreal-Escalante, E., et al. The corn smut-made cholera oral vaccine is thermostable and induces long-lasting immunity in mouse. Journal of Biotechnology. 234, 1-6 (2016).
- Stock, J., et al. Applying unconventional secretion of the endochitinase Cts1 to export heterologous proteins in Ustilago maydis. Journal of Biotechnology. 161, 80-91 (2012).
- van der Linde, K., et al. Pathogen Trojan horse delivers bioactive host protein to alter maize (Zea mays) anther cell behavior in situ. The Plant Cell. 30, 528-542 (2018).
- Bösch, K., et al. Genetic manipulation of the plant pathogen Ustilago maydis to study fungal biology and plant microbe interactions. Journal of Visualized Experiments. , e54522 (2016).
- Chavan, S., Smith, S. M. A rapid and efficient method for assessing pathogenicity of Ustilago maydis on maize and teosinte lines. Journal of Visualized Experiments. 50712, (2014).
- Kelliher, T., Walbot, V. Emergence and patterning of the five cell types of the Zea mays anther locule. Biologia dello sviluppo. 350, 32-49 (2011).
- Egger, R. L., Walbot, V. Quantifying Zea mays. tassel development and correlation with anther developmental stages as a guide for experimental studies. Maydica. 60, M34 (2015).
- Holliday, R., King, R. C. . Bacteria, Bacteriophages, and Fungi: Volume 1. , 575-595 (1974).
- Doehlemann, G., Reissmann, S., Aßmann, D., Fleckenstein, M., Kahmann, R. Two linked genes encoding a secreted effector and a membrane protein are essential for Ustilago maydis-induced tumour formation. Molecular Microbiology. 81, 751-766 (2011).
- Banuett, F., Herskowitz, I. Different a alleles of Ustilago maydis are necessary for maintenance of filamentous growth but not for meiosis. Proceedings of the National Academy of Sciences. 86, 5878-5882 (1989).
- Bortfeld, M., Auffarth, K., Kahmann, R., Basse, C. W. The Ustilago maydis a2 mating-type locus genes lga2 and rga2 compromise pathogenicity in the absence of the mitochondrial p32 family protein Mrb1. The Plant Cell. 16, 2233-2248 (2004).
