Влияние на Fusion партнеров с помощью анализов токсичности Хантингтона в дрожжи флуоресцентных белков
Summary
Эта статья описывает протоколы оценить эффект от флуоресцентных белков на агрегации и токсичность смятых Хантингтона расширения для быстрой оценки недавно uncharacterized флуоресцентный белок в контексте флуоресцентные репортеров.
Abstract
Для расследования локализация протеина и торговли с использованием живых клеток исследователи часто полагаются на сплавляя их протеин интереса для флуоресцентных репортер. Постоянно развивающийся список генетически закодированный флуоресцентных белков (FPs) представляет пользователям с несколько альтернатив когда дело доходит до проектирования флуоресцентные фьюжн. Каждый FP имеет специфические оптических и биофизические свойства, которые могут повлиять на биохимические, сотовой и функциональных свойств результате флуоресцентные сплавливания. Например несколько кадров, как правило, образуют неспецифических олигомеров, которые подвержены препятствуют функции fusion партнером. К сожалению лишь несколько методов существуют для проверки воздействия на поведение флуоресцентные репортер FPs. Здесь мы опишем простой метод, который позволяет быстрой оценки влияния FPs с помощью анализов токсичности Хантингтона (polyQ) в многообещающий дрожжей Saccharomyces cerevisiae. PolyQ Расширенная гентингтина белки связаны с начала болезни Гентингтона (HD), где расширенной гентингтина объединяет в токсичных олигомеров и включение органов. Агрегирование и токсичность polyQ разложений в дрожжи сильно зависит от последовательности фланкируя polyQ региона, в том числе наличие флуоресцентные метки, обеспечивая тем самым идеальное экспериментальной платформы для изучения влияния FPs на поведение их Фьюжн-партнер.
Introduction
Поскольку были разработаны первоначальные характеристики зеленого флуоресцентного белка (ГПУП) от Aequorea victoria1, широкая палитра генетически закодированный FPs, позволяя клеточных биологов одновременно локализации и отслеживания нескольких Сотовый события/белков в живых клетках2,3. FPs являются производными от нескольких организмов, от медуз кораллов, и таким образом, конкретные биофизические свойства отображения, которые отвлекают широко за пределами их соответствующих флуоресцентного спектра. Эти свойства включают яркость, светостойкость и тенденция к oligomerize среди других2,4. Выбор мономерных FPs является важным аспектом в выборе подходящего тега при проектировании флуоресцентный репортер, с тем чтобы свести к минимуму неуместные взаимодействий и изменения функции fusion партнером и максимизировать эффективность репортер для Учитывая сотовой отсек4,5,6. В то время как GFP со временем, была развивались, чтобы свести к минимуму эффект добавления флуоресцентные метки в fusion партнером5,7,8, как новые варианты FP выполняют по сравнению с GFP по-прежнему трудно оценить.
Существуют несколько методы характеризовать поведение FPs. Большинство из них включают проверку биофизические свойства FPs, с использованием биохимических подходов, таких как ultracentrifugation и гель фильтрации протоколов9,10,,1112. Такие методы имеют ограничение использования очищенной FPs в растворе, предлагая меньшюю проницательность в их поведение в нетронутым клеток. Развития предлагает пробирного организованной гладкой эндоплазменный ретикулум (Осер) количественной оценки FPs тенденция к oligomerize в живых клеток13 путем тестирования гиперэкспрессия FPs возможность реорганизовать эндоплазматического ретикулума трубочки в Осер мутовках14. Этот метод может успешно обнаружить изменения между мономерные и олигомерные варианты GFP и другие FPs. Однако она опирается главным образом на гиперэкспрессия временно transfected клеток, и количественный и анализа изображений может занять много времени, если техника принимается как автоматизированный сбор данных и анализ рабочего процесса.
Для того, чтобы дополнять эти подходы, мы создали assay который использует эффект флуоресцентные метки на токсичность и агрегации polyQ разложений в дрожжи15,16. Расширение стрейч polyQ с более чем 36 повторяет в течение первого экзона гена кодирования белок гентингтин (НТТ) связан с болезни Гентингтона17,18. Выражение расширенной Httex1 в дрожжей приводит к сильным агрегации смятых Htt белка, в сочетании с дефектом серьезный рост. Интересно, что эти фенотипы сильно повлияли последовательностей фланкируя polyQ стрейч, включая FPs15,16. Было рационализировано, что различные свойства FPs дифференциально могут повлиять на токсичность polyQ дрожжей. Действительно по сравнению с GFP-подобных FPs, красных флуоресцентных белков и их развивались форм показали снижение токсичности и агрегации16. Эта рукопись содержит подробный протокол для оценки эффекта следующего поколения FPs на polyQ токсичности и агрегации в дрожжей. Этот assay позволяет для быстрого и потенциально высоким содержанием анализа FP вариантов, которые могут использоваться параллельно с ранее охарактеризовать методы для оптимального характеристика новых FPs и может оценить, как они выполняют по сравнению с GFP.
Protocol
Representative Results
Discussion
В этой статье, различных анализов для измерения агрегации Httex1 polyQ разложения и их влияние на рост дрожжей были заняты как модель для изучения как различные флуоресцентные белки изменяют их слияние партнеров в контексте флуоресцентные репортеров . С помощью GFP вариант (ymsfGFP) как поз…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Это исследование поддерживается операционной грант от канадской институтов для медицинских исследований M.L.D. и п.л. Работы, представленные здесь поддерживается Джон р. Эванс руководитель фонда премии от Канадского фонда для инноваций и соответствующий фонд от Фонда исследований Онтарио п.л. Y.J. поддерживается MSc PhD стипендии передачи от декан Шулиха Школа M edicine и стоматологии в университете Западного Онтарио. S.D.G. поддерживается PhD стипендии от ALS Канады.
Materials
| 5-alpha Competent E. coli (High efficiency) | New Englanfd Biolab | C2987 | |
| SpeI-HF | New Englanfd Biolab | R3133 | High fidelity enzymes are preferred |
| SalI-HF | New Englanfd Biolab | R0138 | High fidelity enzymes are preferred |
| Agarose | Fisher Scientific | BP160 | |
| LB-Agar | Fisher Scientific | BP1425 | |
| LB-Broth | Fisher Scientific | BP1426 | |
| Ampicilin | Fisher Scientific | BP1760 | |
| PfuUltra High-fidelity DNA Polymerase | Agilent Technologies | 600382 | |
| EPOCH2 microplate spectrophotometer | BioTek Instruments inc | EPOCH2TC | |
| Yeast Pin Replicator | V&P Scientific inc. | VP407AH | |
| SPI imager | S&P Robotics inc. | spImager-M | |
| Zeiss LSM 800 confocal with AryScan | Carl Zeiss Microscopy | LSM 800 | |
| 8 well Lab-Tek imaging chambers | Fisher Scientific | 12565470 | |
| Bio-Dot apparatus | Bio-Rad | 1706545 | |
| Chemi Doc XRS+ | Bio-Rad | 1708265 | |
| anti-FLAG M1 antibody | Sigma-Aldrich | F3040 | |
| Goat anti-mouse IgG alexa 555 secondary antibody | Thermo | A32727 | |
| Plasmid MiniPrep Kit | Fisher Scientific | K0503 | |
| Plasmid Gel extraction Kit | Fisher Scientific | K0831 | |
| PCR Purification Kit | Fisher Scientific | K0702 | |
| Prizm | GraphPad | N/A | |
| TAE (Tris-Acetate-EDTA) | Fisher Scientific | BP13354 |
Riferimenti
- Chalfie, M., Tu, Y., Euskirchen, G., Ward, W. W., Prasher, D. C. Green fluorescent protein as a marker for gene expression. Science. 263 (5148), 802-805 (1994).
- Thorn, K. Genetically encoded fluorescent tags. Molecular Biology of the Cell. 28 (7), 848-857 (2017).
- Shcherbakova, D. M., Subach, O. M., Verkhusha, V. V. Red fluorescent proteins: advanced imaging applications and future design. Angewandte Chemie. 51 (43), 10724-10738 (2012).
- Snapp, E. L. Fluorescent proteins: a cell biologist’s user guide. Trends in Cell Biology. 19 (11), 649-655 (2009).
- Costantini, L. M., et al. A palette of fluorescent proteins optimized for diverse cellular environments. Nature Communications. 6, 7670 (2015).
- Costantini, L. M., Snapp, E. L. Fluorescent proteins in cellular organelles: serious pitfalls and some solutions. DNA and Cell Biology. 32 (11), 622-627 (2013).
- Yang, F., Moss, L. G., Phillips, G. N. The molecular structure of green fluorescent protein. Nature Biotechnology. 14 (10), 1246-1251 (1996).
- Zacharias, D. A., Violin, J. D., Newton, A. C., Tsien, R. Y. Partitioning of lipid-modified monomeric GFPs into membrane microdomains of live cells. Science. 296 (5569), 913-916 (2002).
- Pédelacq, J. -. D., et al. Engineering soluble proteins for structural genomics. Nature Biotechnology. 20 (9), 927-932 (2002).
- Baird, G. S., Zacharias, D. A., Tsien, R. Y. Biochemistry, mutagenesis, and oligomerization of DsRed, a red fluorescent protein from coral. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97 (22), 11984-11989 (2000).
- Laue, T. M., Stafford, W. F. Modern applications of analytical ultracentrifugation. Annual Review of Biophysics and Biomolecular Structure. 28, 75-100 (1999).
- Pédelacq, J. -. D., Cabantous, S., Tran, T., Terwilliger, T. C., Waldo, G. S. Engineering and characterization of a superfolder green fluorescent protein. Nature Biotechnology. 24 (1), 79-88 (2006).
- Costantini, L. M., Fossati, M., Francolini, M., Snapp, E. L. Assessing the tendency of fluorescent proteins to oligomerize under physiologic conditions. Traffic. 13 (5), 643-649 (2012).
- Snapp, E. L., et al. Formation of stacked ER cisternae by low affinity protein interactions. The Journal of Cell Biology. 163 (2), 257-269 (2003).
- Duennwald, M. L., Jagadish, S., Muchowski, P. J., Lindquist, S. Flanking sequences profoundly alter polyglutamine toxicity in yeast. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (29), 11045-11050 (2006).
- Jiang, Y., Di Gregorio, S. E., Duennwald, M. L., Lajoie, P. Polyglutamine toxicity in yeast uncovers phenotypic variations between different fluorescent protein fusions. Traffic. 18 (1), 58-70 (2017).
- Penney, J. B., Vonsattel, J. P., MacDonald, M. E., Gusella, J. F., Myers, R. H. CAG repeat number governs the development rate of pathology in Huntington’s disease. Annals of Neurology. 41 (5), 689-692 (1997).
- Gusella, J. F., MacDonald, M. E. Huntington’s disease: seeing the pathogenic process through a genetic lens. Trends in Biochemical Sciences. 31 (9), 533-540 (2006).
- Albakri, M. B., Jiang, Y., Lajoie, P. Polyglutamine toxicity assays highlight the advantages of mScarlet for imaging in Saccharomyces cerevisiae [version 1; referees: 1 approved, 1 approved with reservations]. F1000Research. 7, 1242 (2018).
- Schindelin, J., Rueden, C. T., Hiner, M. C., Eliceiri, K. W. The ImageJ ecosystem: An open platform for biomedical image analysis. Molecular Reproduction and Development. 82 (7-8), 518-529 (2015).
- Duennwald, M. L. Yeast as a platform to explore polyglutamine toxicity and aggregation. Methods in Molecular Biology. 1017, 153-161 (2013).
- Duennwald, M. L., Jagadish, S., Giorgini, F., Muchowski, P. J., Lindquist, S. A network of protein interactions determines polyglutamine toxicity. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (29), 11051-11056 (2006).
- Lee, S., Lim, W. A., Thorn, K. S. Improved blue, green, and red fluorescent protein tagging vectors for S. cerevisiae. Plos One. 8 (7), e67902 (2013).
- Halfmann, R., Lindquist, S. Screening for amyloid aggregation by Semi-Denaturing Detergent-Agarose Gel Electrophoresis. Journal of Visualized Experiments. (17), e838 (2008).
- Sikorski, R. S., Hieter, P. A system of shuttle vectors and yeast host strains designed for efficient manipulation of DNA in Saccharomyces cerevisiae. Genetica. 122 (1), 19-27 (1989).
- Thomas, B. J., Rothstein, R. Elevated recombination rates in transcriptionally active DNA. Cell. 56 (4), 619-630 (1989).
- Brachmann, C. B., et al. Designer deletion strains derived from Saccharomyces cerevisiae S288C: a useful set of strains and plasmids for PCR-mediated gene disruption and other applications. Yeast. 14 (2), 115-132 (1998).
- Meriin, A. B., et al. toxicity in yeast model depends on polyglutamine aggregation mediated by a prion-like protein Rnq1. The Journal of Cell Biology. 157 (6), 997-1004 (2002).
- Mumberg, D., Müller, R., Funk, M. Yeast vectors for the controlled expression of heterologous proteins in different genetic backgrounds. Gene. 156 (1), 119-122 (1995).
- Keppler, A., et al. A general method for the covalent labeling of fusion proteins with small molecules in vivo. Nature Biotechnology. 21 (1), 86-89 (2003).
- Tanenbaum, M. E., Gilbert, L. A., Qi, L. S., Weissman, J. S., Vale, R. D. A protein-tagging system for signal amplification in gene expression and fluorescence imaging. Cell. 159 (3), 635-646 (2014).
