Wirkung von fluoreszierenden Proteinen auf Fusion Partner mit Trinukleotiderkrankungen Toxizität Assays in Hefe
Summary
Dieser Artikel beschreibt Protokolle, um die Wirkung von fluoreszierenden Proteinen auf die Aggregation und Toxizität von fehlgefaltete Trinukleotiderkrankungen Erweiterung für die schnelle Bewertung eines neu Fußgelenkes fluoreszierenden Proteins im Rahmen des fluoreszierenden Reporter zu bewerten.
Abstract
Für die Untersuchung von Protein-Lokalisierung und Menschenhandel mit live Cell Imaging setzen Forscher oft auf Absicherung ihrer Protein des Interesses zu einem fluoreszierenden Reporter. Die ständig weiterentwickelnde Liste der genetisch codierten fluoreszierende Proteine (FPs) präsentiert Benutzer mit mehreren Alternativen, wenn es um fluoreszierende Fusion Design kommt. Jedes FP hat bestimmte optische und Biophysikalische Eigenschaften, die die biochemischen, zellulären und funktionellen Eigenschaften der daraus resultierenden fluoreszierenden Fusionen beeinträchtigen können. Zum Beispiel mehrere FPs tendenziell unspezifische Oligomere bilden, die auf die Funktion der Fusion Partner behindern anfällig sind. Leider gibt es nur wenige Methoden, um die Auswirkungen der FPs auf das Verhalten des fluoreszierenden Reporters zu testen. Hier beschreiben wir eine einfache Methode, die es ermöglicht die schnelle Bewertung der Auswirkungen der FPs mit Trinukleotiderkrankungen (PolyQ) Toxizität Assays in der angehenden Hefe Saccharomyces Cerevisiae. PolyQ erweitert Huntingtin-Proteine sind verbunden mit dem Beginn der Huntington-Krankheit (HD), wo die erweiterten Huntingtin in toxischen Oligomeren und Einschlusskörperchen aggregiert. Die Aggregation und Toxizität von PolyQ Erweiterungen in der Hefe sind stark abhängig von der PolyQ-Region, einschließlich das Vorhandensein von fluoreszierenden Tags, wodurch eine ideale experimentelle Plattform zur Untersuchung der Auswirkungen von FPs auf das Verhalten der flankierenden Sequenzen ihre Fusion Partner.
Introduction
Da die ursprüngliche Charakterisierung der das grün fluoreszierende Protein (GFP) aus Aequorea Victoria1, eine breite Palette von genetisch codierte FPs sind entwickelt worden, so dass Zellbiologen, gleichzeitig zu lokalisieren und zu verfolgen mehrere zelluläre Ereignisse/Proteine in lebenden Zellen2,3. FPs stammen aus mehreren Organismen, von Quallen, Korallen, und daher spezielle biophysikalische Anzeigeeigenschaften, die ausführlich über ihre jeweiligen Fluoreszenzspektrum abzulenken. Zu diesen Eigenschaften gehören Helligkeit, Photostabilität und eine Tendenz, unter anderem2,4oligomerize. Auswahl der Monomere FPs ist ein wichtiger Aspekt bei der Auswahl eines geeigneten Tags beim Entwerfen einer fluoreszierenden Reporter, um unangemessene Interaktionen und Veränderungen von der Fusion Partnerrolle zu minimieren und maximieren die Effizienz der Reporter für eine zelluläre Fach4,5,6gegeben. Während GFP hat, im Laufe der Zeit entwickelt wurde, um Minimierung der Auswirkungen der Fusion Partner5,7,8, das fluoreszierende Tag hinzufügen wie neue FP-Varianten im Vergleich zu GFP bleibt schwer zu beurteilen.
Einige Methoden existieren, um das Verhalten der FPs charakterisieren. Die meisten von ihnen beinhalten Tests Biophysikalische Eigenschaften von FPs mit biochemischen Ansätzen, wie z. B. Ultrazentrifugation und gel Filtration Protokolle9,10,11,12. Solche Methoden haben die Einschränkung der Verwendung von gereinigten FPs in Lösung und bieten Einblick in ihr Verhalten in intakten Zellen. Die Entwicklung der organisierten glatte endoplasmatische Retikulum (OSER) Assay Angebote Zellen eine messbare Bewertung der FPs tendenziell in lebenden oligomerize13 von testen, ob der überexprimieren FPs endoplasmatische Retikulum Tubuli in reorganisieren OSER Quirlen14. Diese Technik kann erfolgreich Änderungen zwischen Monomeren und Oligomere Varianten der GLP und anderen FPs erkennen. Aber es stützt sich vor allem auf Überexpression in vorübergehend transfizierten Zellen, und die Quantifizierung und Bildanalyse können zeitaufwändig sein, es sei denn, die Technik als automatisierte Datenerfassung und Analyse Workflow angenommen wird.
Um diese Ansätze zu ergänzen, haben wir eine Probe, die die Wirkung von fluoreszierenden Tags zur Toxizität und Aggregation von PolyQ Erweiterungen in Hefe15,16nutzt. Der Ausbau der PolyQ Strecke mit mehr als 36 wiederholt innerhalb der ersten Exon Gene kodieren, das Huntingtin (Htt) mit Chorea Huntington17,18verbunden ist. Der Ausdruck des erweiterten Httex1 in Hefe führt zu einer starken Aggregation fehlgefaltete Htt-Protein gekoppelt mit einem starken Wachstum defekt. Interessanterweise sind diese Phänotypen flankieren die PolyQ Strecke, einschließlich FPs15,16Sequenzen stark beeinflusst. Es wurde rationalisiert, dass die verschiedenen Eigenschaften der FPs differentiell PolyQ Toxizität in der Hefe beeinflussen können. In der Tat haben im Vergleich zu GFP-wie FPs, rot fluoreszierende Proteine und ihre entwickelten Formen eine geringere Toxizität und Aggregation16gezeigt. Diese Handschrift enthält ein detailliertes Protokoll zur Beurteilung der Wirkung der nächsten Generation von FPs auf PolyQ Toxizität und Aggregation in der Hefe. Dieser Assay ermöglicht eine schnelle und potenziell hohen Inhalt Analyse von FP-Varianten, die parallel verwendet werden können, vorher gekennzeichnet Techniken für die optimale Charakterisierung von neuen FPs und kann beurteilen, wie sie im Vergleich zu GFP durchführen.
Protocol
Representative Results
Discussion
In diesem Artikel wurden verschiedene Tests zur Messung der Aggregation von Httex1 PolyQ Erweiterungen und deren Wirkung auf das Wachstum der Hefe als Modell eingesetzt, um studieren wie verschiedene fluoreszierende Proteine verändern ihre Fusion Partner im Zusammenhang mit fluoreszierenden Reporter . Eine GLP-Variante (YmsfGFP) zeigten als Positivkontrolle wir, dass dies erhebliche Veränderungen in der PolyQ Toxizität und Aggregation zwischen verschiedenen fluoreszierenden Tags erkennt und einen direkten u…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Studie stützt sich auf einen Betriebskostenzuschuss von der Canadian Institute for Health Research, M.L.D. und p.l. Die hier vorgestellte Arbeit stützt sich auf einen John R. Evans Leader Fund Award der kanadischen Stiftung für Innovation und ein passenden Fonds aus dem Ontario Forschungsfonds, p.l. Y.J. stützt sich auf einen Master of Science, Promotionsstipendium Transfer vom Dekan der Schulich Schule von M Edicine und Zahnmedizin an der Universität von Western Ontario. S.D.G wird unterstützt durch ein Promotionsstipendium aus ALS Kanada.
Materials
| 5-alpha Competent E. coli (High efficiency) | New Englanfd Biolab | C2987 | |
| SpeI-HF | New Englanfd Biolab | R3133 | High fidelity enzymes are preferred |
| SalI-HF | New Englanfd Biolab | R0138 | High fidelity enzymes are preferred |
| Agarose | Fisher Scientific | BP160 | |
| LB-Agar | Fisher Scientific | BP1425 | |
| LB-Broth | Fisher Scientific | BP1426 | |
| Ampicilin | Fisher Scientific | BP1760 | |
| PfuUltra High-fidelity DNA Polymerase | Agilent Technologies | 600382 | |
| EPOCH2 microplate spectrophotometer | BioTek Instruments inc | EPOCH2TC | |
| Yeast Pin Replicator | V&P Scientific inc. | VP407AH | |
| SPI imager | S&P Robotics inc. | spImager-M | |
| Zeiss LSM 800 confocal with AryScan | Carl Zeiss Microscopy | LSM 800 | |
| 8 well Lab-Tek imaging chambers | Fisher Scientific | 12565470 | |
| Bio-Dot apparatus | Bio-Rad | 1706545 | |
| Chemi Doc XRS+ | Bio-Rad | 1708265 | |
| anti-FLAG M1 antibody | Sigma-Aldrich | F3040 | |
| Goat anti-mouse IgG alexa 555 secondary antibody | Thermo | A32727 | |
| Plasmid MiniPrep Kit | Fisher Scientific | K0503 | |
| Plasmid Gel extraction Kit | Fisher Scientific | K0831 | |
| PCR Purification Kit | Fisher Scientific | K0702 | |
| Prizm | GraphPad | N/A | |
| TAE (Tris-Acetate-EDTA) | Fisher Scientific | BP13354 |
Riferimenti
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