Effect van fluorescente proteïnen op Fusion Partners Polyglutamine Toxicity Tests met gist
Summary
Dit artikel beschrijft protocollen voor de beoordeling van het effect van fluorescente proteïnen op de aggregatie en toxiciteit van de expansie van de misfolded polyglutamine voor de snelle evaluatie van een nieuw genfunctieonderzoek TL proteïne in het kader van fluorescerende verslaggevers.
Abstract
Voor het onderzoek van eiwitten lokalisatie en handel met behulp van levende cellen imaging, afhankelijk onderzoekers vaak van hun proteïne van belang aan een fluorescerende verslaggever smelten. De voortdurend evoluerende lijst van genetisch gecodeerde fluorescente proteïnen (FPs) presenteert gebruikers met verschillende alternatieven als het gaat om TL fusion ontwerp. Elke FP heeft specifieke eigenschappen voor optische en biofysische die de biochemische, cellulaire en functionele eigenschappen van de resulterende fluorescentie fusies beïnvloeden kunnen. Bijvoorbeeld, de verschillende FOD neiging om vormen van niet-specifieke oligomeren die vatbaar zijn voor het belemmeren van de functie van de fusion-partner. Helaas, slechts een paar methoden bestaan om te testen van het effect van FPs op het gedrag van de fluorescerende verslaggever. Hier beschrijven we een eenvoudige methode waarmee de snelle beoordeling van de gevolgen van FPs met behulp van polyglutamine (polyQ) toxiciteit testen in de ontluikende gist Saccharomyces cerevisiae. PolyQ-uitgebreid huntingtin eiwitten zijn gekoppeld aan het begin van de ziekte van Huntington (HD), waar de uitgebreide huntingtin aggregaten in giftige oligomeren en integratie-organen. De aggregatie en toxiciteit van polyQ uitbreidingen in gist zijn sterk afhankelijk van de opeenvolgingen flankerend de polyQ regio, waaronder de aanwezigheid van fluorescerende labels, waardoor het een ideale experimenteel platform om te bestuderen van de impact van FPs op het gedrag van hun fusie partner.
Introduction
Aangezien de eerste karakterisering van de groen fluorescente proteïne (GFP) van Aequorea victoria1, een breed palet van genetisch gecodeerde FPs zijn ontwikkeld, waardoor cel biologen tegelijkertijd lokaliseren en bijhouden meerdere cellulaire gebeurtenissen/eiwitten in levende cellen2,3. FPs zijn afgeleid van meerdere organismen, uit kwallen koraal, en derhalve specifieke biofysische beeldschermeigenschappen die uitgebreid buiten hun respectieve fluorescerende spectrum afleiden. Deze eigenschappen omvatten helderheid, fotostabiliteit en een neiging tot oligomerize onder andere2,4. Het selecteren van monomeer FPs is een belangrijk aspect bij de keuze van een geschikte label tijdens het ontwerpen van een fluorescerende verslaggever, om ongepaste interacties en wijzigingen van de functie van de partner van de fusie te minimaliseren en maximaliseren van de efficiëntie van de verslaggever voor een cellulaire compartiment4,5,6gegeven. Terwijl GFP, na verloop van tijd is geëvolueerd om te minimaliseren van het effect van de fluorescerende tag toe te voegen aan de fusie partner5,7,8, hoe nieuwe FP varianten ten opzichte van presteren GFP blijft moeilijk in te schatten.
Er bestaan enkele methoden karakteriseren van het gedrag van de FOD. De meeste van hen betrekken biofysische eigenschappen van FPs met behulp van biochemische benaderingen, zoals ultracentrifugatie testen en gel filtratie protocollen9,10,11,12. Dergelijke methoden hebben de valkuil van het gebruik van gezuiverde FPs in oplossing, het aanbieden van weinig inzicht in hun gedrag in onbeschadigde cellen. De ontwikkeling van de georganiseerde Glad endoplasmatisch reticulum (OSER) assay aanbiedingen een kwantificeerbare beoordelingvan FPs neiging tot oligomerize in levende cellen13 door het controleren van de mogelijkheid van overexpressie bps te reorganiseren endoplasmatisch reticulum tubuli in OSER slierten14. Deze techniek kan met succes detecteren veranderingen tussen het monomeer en oligomere varianten van GFP en andere FPs. Echter het berust meestal op overexpressie in Transient transfected cellen, en de kwantificatie en beeldanalyse tijdrovend kunnen zijn tenzij de techniek wordt aangenomen als een automatische gegevensverzameling en analyse workflow.
Ter aanvulling van deze benaderingen, opgericht wij een bepaling die van het effect van fluorescerende tags op de toxiciteit en aggregatie van polyQ uitbreidingen in gist15,16 profiteert. De uitbreiding van het polyQ traject met meer dan 36 herhaalt binnen de eerste exon de gene codering van dat het eiwit huntingtin (Htt) is geassocieerd met de ziekte van Huntington17,18. De expressie van uitgebreide Httex1 gist resulteert in een sterke aggregatie van het misfolded Htt-eiwit dat is gekoppeld aan een ernstige groei defect. Interessant is dat zijn deze fenotypen sterk beïnvloed door de het polyQ traject, met inbegrip van FPs15,16flankerende sequenties. Het werd gerationaliseerd dat de verschillende eigenschappen van FPs differentieel polyQ toxiciteit in gist kunnen beïnvloeden. Inderdaad, in vergelijking met GFP-achtige FPs, rode fluorescerende eiwitten en hun geëvolueerd vormen hebben aangetoond een verminderde toxiciteit en aggregatie16. Dit manuscript verstrekt een gedetailleerd protocol voor de beoordeling van het effect van de volgende generatie van FPs op polyQ toxiciteit en aggregatie in gist. Deze bepaling staat voor een snelle en potentieel hoge-content analyse van FP-varianten die kunnen worden gebruikt in parallel met eerder gekenmerkt technieken voor de optimale karakterisering van nieuwe FPs en kan beoordelen hoe ze presteren ten opzichte van GFP.
Protocol
Representative Results
Discussion
In dit artikel verschillende testen om te meten de aggregatie van Httex1 polyQ uitbreidingen en hun effect op de groei van de gist werkten als een model om te bestuderen hoe de verschillende TL eiwitten veranderen hun fusie-partners in het kader van fluorescerende verslaggevers . Met behulp van een GFP-variant (ymsfGFP) als positieve controle, toonden we dat dit belangrijke veranderingen in polyQ toxiciteit en aggregatie tussen verschillende TL tags detecteert en zorgt voor een directe en snelle vergelijking v…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Deze studie wordt ondersteund door een subsidie voor huishoudelijke uitgaven van de Canadese instituten voor gezondheidsonderzoek naar M.L.D. en P.L. Het werk hier gepresenteerd wordt ondersteund door een John R. Evans leider Fund award van de Canadese Stichting voor innovatie en een bijpassende Fonds van het onderzoeksfonds Ontario P.L. Y.J. wordt ondersteund door een MSc naar PhD scholarship van de overdracht van de decaan van de School van de Schulich van M edicine en tandheelkunde aan de University of Western Ontario. S.D.G. wordt ondersteund door een PhD Scholarship uit ALS Canada.
Materials
| 5-alpha Competent E. coli (High efficiency) | New Englanfd Biolab | C2987 | |
| SpeI-HF | New Englanfd Biolab | R3133 | High fidelity enzymes are preferred |
| SalI-HF | New Englanfd Biolab | R0138 | High fidelity enzymes are preferred |
| Agarose | Fisher Scientific | BP160 | |
| LB-Agar | Fisher Scientific | BP1425 | |
| LB-Broth | Fisher Scientific | BP1426 | |
| Ampicilin | Fisher Scientific | BP1760 | |
| PfuUltra High-fidelity DNA Polymerase | Agilent Technologies | 600382 | |
| EPOCH2 microplate spectrophotometer | BioTek Instruments inc | EPOCH2TC | |
| Yeast Pin Replicator | V&P Scientific inc. | VP407AH | |
| SPI imager | S&P Robotics inc. | spImager-M | |
| Zeiss LSM 800 confocal with AryScan | Carl Zeiss Microscopy | LSM 800 | |
| 8 well Lab-Tek imaging chambers | Fisher Scientific | 12565470 | |
| Bio-Dot apparatus | Bio-Rad | 1706545 | |
| Chemi Doc XRS+ | Bio-Rad | 1708265 | |
| anti-FLAG M1 antibody | Sigma-Aldrich | F3040 | |
| Goat anti-mouse IgG alexa 555 secondary antibody | Thermo | A32727 | |
| Plasmid MiniPrep Kit | Fisher Scientific | K0503 | |
| Plasmid Gel extraction Kit | Fisher Scientific | K0831 | |
| PCR Purification Kit | Fisher Scientific | K0702 | |
| Prizm | GraphPad | N/A | |
| TAE (Tris-Acetate-EDTA) | Fisher Scientific | BP13354 |
References
- Chalfie, M., Tu, Y., Euskirchen, G., Ward, W. W., Prasher, D. C. Green fluorescent protein as a marker for gene expression. Science. 263 (5148), 802-805 (1994).
- Thorn, K. Genetically encoded fluorescent tags. Molecular Biology of the Cell. 28 (7), 848-857 (2017).
- Shcherbakova, D. M., Subach, O. M., Verkhusha, V. V. Red fluorescent proteins: advanced imaging applications and future design. Angewandte Chemie. 51 (43), 10724-10738 (2012).
- Snapp, E. L. Fluorescent proteins: a cell biologist’s user guide. Trends in Cell Biology. 19 (11), 649-655 (2009).
- Costantini, L. M., et al. A palette of fluorescent proteins optimized for diverse cellular environments. Nature Communications. 6, 7670 (2015).
- Costantini, L. M., Snapp, E. L. Fluorescent proteins in cellular organelles: serious pitfalls and some solutions. DNA and Cell Biology. 32 (11), 622-627 (2013).
- Yang, F., Moss, L. G., Phillips, G. N. The molecular structure of green fluorescent protein. Nature Biotechnology. 14 (10), 1246-1251 (1996).
- Zacharias, D. A., Violin, J. D., Newton, A. C., Tsien, R. Y. Partitioning of lipid-modified monomeric GFPs into membrane microdomains of live cells. Science. 296 (5569), 913-916 (2002).
- Pédelacq, J. -. D., et al. Engineering soluble proteins for structural genomics. Nature Biotechnology. 20 (9), 927-932 (2002).
- Baird, G. S., Zacharias, D. A., Tsien, R. Y. Biochemistry, mutagenesis, and oligomerization of DsRed, a red fluorescent protein from coral. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97 (22), 11984-11989 (2000).
- Laue, T. M., Stafford, W. F. Modern applications of analytical ultracentrifugation. Annual Review of Biophysics and Biomolecular Structure. 28, 75-100 (1999).
- Pédelacq, J. -. D., Cabantous, S., Tran, T., Terwilliger, T. C., Waldo, G. S. Engineering and characterization of a superfolder green fluorescent protein. Nature Biotechnology. 24 (1), 79-88 (2006).
- Costantini, L. M., Fossati, M., Francolini, M., Snapp, E. L. Assessing the tendency of fluorescent proteins to oligomerize under physiologic conditions. Traffic. 13 (5), 643-649 (2012).
- Snapp, E. L., et al. Formation of stacked ER cisternae by low affinity protein interactions. The Journal of Cell Biology. 163 (2), 257-269 (2003).
- Duennwald, M. L., Jagadish, S., Muchowski, P. J., Lindquist, S. Flanking sequences profoundly alter polyglutamine toxicity in yeast. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (29), 11045-11050 (2006).
- Jiang, Y., Di Gregorio, S. E., Duennwald, M. L., Lajoie, P. Polyglutamine toxicity in yeast uncovers phenotypic variations between different fluorescent protein fusions. Traffic. 18 (1), 58-70 (2017).
- Penney, J. B., Vonsattel, J. P., MacDonald, M. E., Gusella, J. F., Myers, R. H. CAG repeat number governs the development rate of pathology in Huntington’s disease. Annals of Neurology. 41 (5), 689-692 (1997).
- Gusella, J. F., MacDonald, M. E. Huntington’s disease: seeing the pathogenic process through a genetic lens. Trends in Biochemical Sciences. 31 (9), 533-540 (2006).
- Albakri, M. B., Jiang, Y., Lajoie, P. Polyglutamine toxicity assays highlight the advantages of mScarlet for imaging in Saccharomyces cerevisiae [version 1; referees: 1 approved, 1 approved with reservations]. F1000Research. 7, 1242 (2018).
- Schindelin, J., Rueden, C. T., Hiner, M. C., Eliceiri, K. W. The ImageJ ecosystem: An open platform for biomedical image analysis. Molecular Reproduction and Development. 82 (7-8), 518-529 (2015).
- Duennwald, M. L. Yeast as a platform to explore polyglutamine toxicity and aggregation. Methods in Molecular Biology. 1017, 153-161 (2013).
- Duennwald, M. L., Jagadish, S., Giorgini, F., Muchowski, P. J., Lindquist, S. A network of protein interactions determines polyglutamine toxicity. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (29), 11051-11056 (2006).
- Lee, S., Lim, W. A., Thorn, K. S. Improved blue, green, and red fluorescent protein tagging vectors for S. cerevisiae. Plos One. 8 (7), e67902 (2013).
- Halfmann, R., Lindquist, S. Screening for amyloid aggregation by Semi-Denaturing Detergent-Agarose Gel Electrophoresis. Journal of Visualized Experiments. (17), e838 (2008).
- Sikorski, R. S., Hieter, P. A system of shuttle vectors and yeast host strains designed for efficient manipulation of DNA in Saccharomyces cerevisiae. Genetics. 122 (1), 19-27 (1989).
- Thomas, B. J., Rothstein, R. Elevated recombination rates in transcriptionally active DNA. Cell. 56 (4), 619-630 (1989).
- Brachmann, C. B., et al. Designer deletion strains derived from Saccharomyces cerevisiae S288C: a useful set of strains and plasmids for PCR-mediated gene disruption and other applications. Yeast. 14 (2), 115-132 (1998).
- Meriin, A. B., et al. toxicity in yeast model depends on polyglutamine aggregation mediated by a prion-like protein Rnq1. The Journal of Cell Biology. 157 (6), 997-1004 (2002).
- Mumberg, D., Müller, R., Funk, M. Yeast vectors for the controlled expression of heterologous proteins in different genetic backgrounds. Gene. 156 (1), 119-122 (1995).
- Keppler, A., et al. A general method for the covalent labeling of fusion proteins with small molecules in vivo. Nature Biotechnology. 21 (1), 86-89 (2003).
- Tanenbaum, M. E., Gilbert, L. A., Qi, L. S., Weissman, J. S., Vale, R. D. A protein-tagging system for signal amplification in gene expression and fluorescence imaging. Cell. 159 (3), 635-646 (2014).
