增强型绿色荧光蛋白表达大肠杆菌评价小鼠腹腔巨噬细胞吞噬细胞增多
Summary
在这里, 我们提出了一个评估小鼠腹腔巨噬细胞吞噬使用增强绿色荧光蛋白表达大肠杆菌的方案.
Abstract
这份手稿描述了一种简单和可重复的方法来进行吞噬试验。该方法的第一部分涉及建立一个 pet-sumo-egfp 矢量 (sumo = 小泛素样改性剂), 并在大肠杆菌(bl21de) 中表达增强的绿色荧光蛋白 (egfp)。在37°c 条件下, 与巨噬细胞共培养 1小时;负对照组在冰上孵育相同时间。然后, 巨噬细胞就可以进行评估了。该技术的优点包括步骤简单、简单, 流式细胞仪和荧光显微镜均可测量吞噬能力。即使巨噬细胞与甲醛固定, egfp 表达大肠杆菌也是稳定的, 即使在巨噬细胞固定后也能显示出强烈的荧光信号。该方法不仅适用于巨噬细胞系或原代巨噬细胞的体外评估, 而且适用于外周血单个核细胞粒细胞和单核细胞吞噬的评价。结果表明, 小 (8周) 小鼠腹腔巨噬细胞的吞噬能力高于老年 (16个月大) 小鼠的巨噬细胞。总之, 该方法能测定巨噬细胞吞噬, 适用于先天免疫系统功能的研究。
Introduction
巨噬细胞吞噬检测常用于研究先天免疫功能。先天免疫反应可能表明易受感染。巨噬细胞系在免疫学研究中得到了广泛的应用。然而, 延长的通道可能会导致基因丢失和这些细胞系的免疫功能受损。因此, 原代腹腔巨噬细胞是研究细胞功能1的理想对象。
虽然先天免疫反应被认为是完整的在老年身体,吞噬能力可能会下降相比, 在年轻的身体2, 3。在这里, 我们将演示一种方法来评估腹腔巨噬细胞的吞噬细胞的年轻 (8周大) 和老年 (16个月大) 使用 egfp 表达大肠杆菌, 这是方便, 快速, 经济上可行的。
使用表达 egfp 的大肠杆菌菌株是本方法的优点之一, 因为这些细菌是稳定的, 并显示强烈的荧光信号, 即使在巨噬细胞固定 4% (w/v) 甲醛。此外, 通过使用表达 egfp 的大肠杆菌, 研究人员不需要进一步染色后吞噬, 这节省了时间。此外, 巨噬细胞对大肠杆菌表面抗原具有免疫耐受性, 使大肠杆菌比使用表达 egfp 的真菌或荧光标记的珠子更适合进行吞噬试验。
使用表达 egfp 的大肠杆菌, 可以很容易地在2小时内完成吞噬检测, 并根据研究人员的用途, 通过流式细胞仪和荧光显微镜进行测量。由于该方法直接测量吞噬能力, 其结果比其他间接方法更具有重现性。
该方法也已在 raw264.7 细胞系和人外周血单个核细胞4中得到验证。下面的文本提供了执行此检测的详细分步说明, 并强调了研究人员可能修改以满足其实验需求的关键步骤。
Protocol
Representative Results
Discussion
此协议中的步骤非常简单和直接。其中一个关键的步骤是诱导 egfp 在大肠杆菌上的表达。通常, 当一个来自真核生物的基因, 如 egfp, 计划用原核生物表达像大肠杆菌, 有风险的蛋白质将形成不活跃的聚集物 (包涵体), 这改变了蛋白质的原生结构和活性。利用 pet-sumo 载体构造 pet-sumo-egfp 质粒, 成功表达了 egfp-sumo 融合蛋白, 光信号强到足以被荧光显微镜和流式细胞仪检测。
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The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
中国国家自然科学基金 (第3180046号) 和辽宁省自然科学基金 (20170540262) 对这项工作给予了支持。这项工作是在大连医科大学第二医院科研中心的实验室完成的。作者要感谢桑小林对流式细胞术的协助, 感谢博曲和杨东川在制作视频方面的协助。
Materials
| BD FACSCanto II Flow cytometer | BD Biosciences | – | |
| Biotin anti-mouse CD16/32 Antibody | Biolegend | Cat101303 | |
| Champion pET SUMO Protein Expression system | Invitrogen | K300-01 | |
| Custom Gene Synthesis Service | Takara Biotech. | – | |
| DAPI(4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) | ThermoFisher | D1306 | |
| F4/80-PE anti-mouse antibody for FACS | Biolegend | Cat123110 | |
| Leica DMI3000 B Inverted Microscope | Leica Microsystems | – | |
| PE Rat IgG2a, κ-isotype control | Biolegend | Cat400507 | |
| Phalloidin 633 fluorescence dye conjugated working solution | AAT Bioquest | Cat23125 | |
| Thioglycollate medium | Sigma-Aldrich | T9032 |
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