Qui, presentiamo un protocollo per valutare la fagocitosi dei macrofagi peritoneali del mouse usando una maggiore fluorescenza verde Escherichia coliche esprimono proteine.
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Articolo metodologico
Utilizzando Enhanced fluorescenza verde che esprimono proteine Escherichia Coli per valutare la fagocitosi dei macrofagi peritoneali del Mouse
* These authors contributed equally
In questo articolo
Sommario
Abstract
Questo manoscritto descrive un metodo semplice e riproducibile per eseguire un test di fagocitosi. La prima parte di questo metodo prevede la costruzione di un vettore di animali-SUMO-EGFP (SUMO = piccolo ubiquitina-come modificatore) e che esprimono una maggiore proteina di fluorescenza verde (EGFP) in Escherichia coli (BL21DE). Che esprimono EGFP e. coli è coincubated con i macrofagi per 1h a 37 ° C; il gruppo di controllo negativo viene incubato in ghiaccio per la stessa quantità di tempo. Quindi, i macrofagi sono pronti per la valutazione. I vantaggi di questa tecnica includono i passi semplici e diretti, e fagocitosi possono essere misurata con entrambi microscopio di fluorescenza e cytometer di flusso. Il che esprimono EGFP e. coli sono stabili e visualizzare un segnale di fluorescenza forte anche dopo i macrofagi sono fissati con paraformaldeide. Questo metodo non è solo adatto per la valutazione delle linee cellulari del macrofago o macrofagi primari in vitro ma adatto anche per la valutazione della fagocitosi di granulociti e monociti in cellule mononucleari del sangue periferico. I risultati mostrano che la capacità fagocitica dei macrofagi peritoneali dai giovani topi (otto-settimana-vecchio) è superiore a quella dei macrofagi dai topi invecchiati (16 mesi). In sintesi, questo metodo misura la fagocitosi del macrofago ed è adatto per studiare la funzione del sistema immunitario innato.
Introduzione
Saggi di fagocitosi del macrofago sono spesso utilizzati per studiare la funzione immunitaria innata. La risposta immunitaria innata può indicare la suscettibilità all'infezione. Linee cellulari del macrofago sono ampiamente utilizzate negli studi di immunologia. Tuttavia, il passaggio prolungato può causare la perdita del gene e compromesse funzioni immuni in queste linee cellulari. Così, i macrofagi peritoneali primari sono l'oggetto ideale in cui studiare la funzione delle cellule1.
Anche se la risposta immunitaria innata è stata pensata per essere intatto nel corpo invecchiato, può fare diminuire la capacità fago....
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Protocollo
Tutte le procedure sono state effettuate nell'ambito degli istituti nazionali di salute orientamenti per la cura e l'uso di animali da laboratorio e i protocolli sono stati approvati dalla cura degli animali e uso Comitato di Dalian Medical University. Sedici mesi (con un peso corporeo di 30-35 g) e otto-settimana-vecchio topo C57BL/6 (specifiche-patogeno-free) maschio (20-25 g) SPF sono stati ottenuti dal centro animale SPF dell'Università medica di Dalian. Tutti i topi sono stati tenuti in custodia degli animali con accesso a cibo e acqua ad libitum. La temperatura è stata mantenuta a 20-24 ° C, umidità era 40% - 70%, e l'illuminazione era 12 h luce/12 h sc....
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Risultati
Il vettore di animali-SUMO utilizza un modificatore di ubiquitin-come piccolo per consentire l'espressione di proteine native in Escherichia coli. Fusione di SUMO può significativamente aumentare la solubilità EGFP, permettendo così di essere individuati facilmente. Se l'espressione di EGFP correttamente è indotta da lattosio, colonie verde possono essere osservate nel buio (Figura 1A). Puntini verdi, che rappresentano il che esprimono EGFP e. co.......
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Discussione
La procedura descritta in questo protocollo è abbastanza semplice e lineare. Una delle fasi critiche è di indurre l'espressione di EGFP su e. coli. Di solito, quando un gene da eucarioti, come EGFP, è progettato per esprimere nei procarioti come e. coli, c'è un rischio che la proteina si forma aggregati inattivi (corpi di inclusione), che cambia la struttura nativa e l'attività della proteina. Utilizzando il vettore animale-SUMO e costruendo il plasmide di animali-SUMO-EGFP, la proteina di fusione di EG.......
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla a rivelare.
Ringraziamenti
La Fondazione di scienza naturale nazionale della Cina (No. 31800046) e la Fondazione con scienze naturali della provincia di Liaoning (No. 20170540262) sostenuto questo lavoro. Questo lavoro è stato compiuto nei laboratori del centro di ricerca scientifica all'università secondo ospedale di Dalian medica. Gli autori vorrei ringraziare Xiao Lin Sang per la sua assistenza con la citometria a flusso e Bo Qu e Yang Dong-Chuan per la loro assistenza nella produzione video.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| BD FACSCantometro a flusso II | BD Biosciences-Biotina | ||
| anti-topo CD16/32 Anticorpo | Biolegend | Cat101303 | |
| Champion pET SUMO Sistema di espressione proteica | Invitrogen | K300-01 | |
| Servizio di sintesi genica personalizzato | Takara Biotech. | - | |
| DAPI(4',6-Diamidino-2-Fenilindolo, Dicloridrato) | ThermoFisher | D1306 | |
| F4/80-PE anticorpo di topo per FACS | Biolegend | Cat123110 | |
| Leica DMI3000 B Microscopio invertito | Leica Microsystems-PE | ||
| Rat IgG2a, controllo dell'isotipo | Biolegend | Cat400507 | |
| Falloidina 633 colorante a fluorescenza soluzione di lavoro coniugata | AAT Bioquest | Cat23125 | |
| Terreno tioglicolato | Sigma-Aldrich | T9032 |
Riferimenti
- Layoun, A., Samba, M., Santos, M. M. Isolation of murine peritoneal macrophages to carry out gene expression analysis upon Toll-like receptors stimulation. Journal of Visualized Experiments. 98, e52749(2015).
- Iskander, K. N., et al.
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Ristampe e permessi
