JoVE Journal > Biochemistry
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Risultati
Discussion
Divulgazioni
Acknowledgements
Materials
Riferimenti
Traduzione automatica
Biochimica

Proteinekspression og -oprensning af menneskelige Lipid-følsomme kation kanal TRPC3 for Strukturbestemmelse af enkelt-partikel kryo-elektronmikroskopi

Published: January 07, 2019
doi:
10.3791/58754
, , , , ,
1Van Andel Institute, 2Vollum Institute, 3Janelia Research Campus

Summary

Denne protokol beskriver teknikker, der anvendes til at bestemme ion-kanal strukturer af kryo-elektronmikroskopi, herunder en baculovirus, der anvendes til effektivt express gener i pattedyrceller med minimalt besvær og toksicitet, protein udvinding, rensning, og kvalitet kontrol, gitter forberedelse af prøver og screening, samt indsamling af data og forarbejdning.

Abstract

Forbigående receptor potentielle kanaler (TRPCs) af de kanoniske TRP underfamilie er nonselective kation kanaler, der spiller en afgørende rolle i calcium homeostase, især butik-drevet calcium indrejse, der er afgørende for at opretholde ordentlig funktion af Synaptic vesikel frigivelse og intracellulær signalering veje. Derfor har TRPC kanaler været impliceret i en bred vifte af menneskelige sygdomme, herunder hjerte-kar-lidelser som Hjertehypertrofi, neurodegenerative sygdomme som Parkinsons sygdom og neurologiske sygdomme såsom spinocerebellar ataksi. Derfor repræsenterer TRPC kanaler et potentielle farmakologiske mål i menneskelige sygdomme. De molekylære mekanismer af gating i disse kanaler er dog stadig uklart. Er svært at opnå store mængder af stabile, homogene og renset protein har været en begrænsende faktor i struktur bestemmelse undersøgelser, især for pattedyr Membranproteiner såsom TRPC Ionkanaler. Vi præsenterer her, en protokol for den store udtryk for pattedyr ion-kanal Membranproteiner ved hjælp af en modificeret baculovirus gen transfersystemet og rensning af disse proteiner af affinitet og størrelse-udelukkelse kromatografi. Yderligere præsenterer vi en protokol til at indsamle enkelt-partikel cryo-Elektron Mikroskopi billeder fra oprenset protein og bruge disse billeder til at bestemme protein struktur. Struktur bestemmelse er en kraftfuld metode til at forstå mekanismerne af gating og funktion i Ionkanaler.

Introduction

Calcium er involveret i de fleste cellulære processer herunder signalering cascades, transskription kontrol, neurotransmitter frigivelse og hormon molekyle syntese1,2,3. Det homeostatiske vedligeholdelse af cytosole gratis calcium er afgørende for sundhed og funktion af celler. En af de vigtigste mekanismer af intracellulære calcium homeostase er butik-drevet calcium post (SOCE), en proces, hvori opbevares nedbrydning af calcium i det endoplasmatiske reticulum (ER) udløser åbning af Ionkanaler på plasma membran til at lette de genbestilling af ER calcium, som derefter kan bruges i yderligere signalering4,5,6. Forbigående receptor potentielle kanaler (TRPCs), som er calcium-gennemtrængelige kanaler tilhører TRP superfamilien, er blevet identificeret som en vigtig deltager i SOCE7,8,9 .

Blandt de syv medlemmer i familien TRPC, TRPC3, TRPC6 og TRPC7 udgør en homolog undergruppe, og de er unikke evne til at blive aktiveret af lipid sekundære messenger diacylglycerol (DAG), en nedbrydning produkt af den signaling lipid phosphatidylinositol 4,5-bisfosfat (PIP2)10,11. TRPC3 er stærkt udtrykt i glatte muskulatur og i de cerebrale og cerebellare regioner af hjernen, hvor det spiller afgørende roller i calcium signalering, der påvirker neurotransmission og neurogenese12,13. Dysfunktion af TRPC3 har været knyttet til central nervesystemet, hjerte-kar-lidelser og visse kræftformer såsom æggestokkene adenocarcinom14,15,16. Derfor holder TRPC3 løfte som farmaceutiske mål for behandling af disse sygdomme. Udvikling af specielt målrettet narkotika handler på TRPC3 har været begrænset af mangel på forståelse af dens molekylære aktivering mekanismer, herunder lipid bindende websteder17,18. Vi har rapporteret første atomic-opløsning strukturen af den menneskelige TRPC3 kanal (hTRPC3) og dens to lipid bindingssteder i lukket tilstand, give vigtig indsigt i disse mekanismer19.

Den vigtigste faktor til at bestemme strukturen af en membran proteiner med høj opløsning er at få protein af høj kvalitet. Tilsvarende screening af proteinekspression og -oprensning betingelser for at opnå høj kvalitet protein kan være en tidskrævende og dyre bestræbelse. Her præsenterer vi en protokol, der beskriver i detaljer hvordan vi identificere de optimale betingelser for den proteinekspression og -oprensning af hTRPC3, som opførte sig dårligt i vores indledende screening. Vi præsenterer flere vigtige punkter om, hvordan fejlfinding og optimere protein adfærd, som lå et solidt fundament for vores cryo-Elektron Mikroskopi (cryo-EM) undersøgelser. Vi bruger en modificeret baculoviral generere vektor (pind), udviklet af Gouaux og kolleger, som er optimeret til screening-assays og effektiv generation af baculovirus i pattedyrceller20. Dette udtryk metode er velegnet til hurtig og omkostningseffektiv overekspression af proteiner i pattedyr cellemembranen. Vi kombinerer brugen af denne vektor med en registrering af fluorescens størrelse-udelukkelse kromatografi-baseret (FSEC) prescreening metode21. Denne metode bruger et grønt fluorescerende proteiner (NGL) tag smeltet til konstruktionen af interesse og forbedrer visualisering af target proteinet i små, hele-celle solubilized prøver. Dette giver mulighed for screening af protein stabilitet i overværelse af forskellige vaskemidler og tilsætningsstoffer, med thermostabilizing mutationer, og tillader brug af et lille antal celler fra små forbigående Transfektion. På denne måde, kan en lang række betingelser screenes hurtigt før du flytter til en storstilet protein oprensning. Efter udtryk, screening og rensning præsenterer vi en protokol for at opnå og behandling af billeder fra cryo-EM til at generere en de novo Strukturbestemmelse af proteiner. Vi mener, at metoderne beskrevet her vil tjene som et generaliserbart protokol for strukturelle undersøgelser af TRP kanal receptorer og andre Membranproteiner.

Protocol

1. forvandling af DH10α kompetente celler til at producere Bacmid DNA Syntetisere gen af interesse og subclone det i en modificeret udgave af den pind vektor indeholdende en twin strep-tag, His8-tag og normal god landbrugspraksis med en thrombin kavalergang site på N terminus (pFastBacI)20. Omdanne kompetente celler ved at tilføje 5 ng af plasmid indeholder et ønskede gen i pFastBacI til 50 μl DH10α celler i en 1,5 mL tube og inkuberes i 10 min. på køl. Heat shock celle…

Representative Results

En skematisk oversigt over protokollen for udtryk og rensning af hTRPC3 er vist i figur 1A. Et billede af hTRPC3 bacmid pladen med ideelle hvide kolonier, ligner den en udvalgt til bacmid DNA oprensning, er vist i figur 1B. Vi fandt, at 48 h er ideel til klare Bluo-gal farvning fastholdes tilstedeværelsen af isolerede kolonier. Peak produktion af P2 virus for hTRPC3, som visualiseret ved normal god landbrugspraksis fluorescens, …

Discussion

Strukturbestemmelse af proteiner af cryo-EM har revolutioneret inden for strukturel biologi i de sidste par år, takket være udviklingen af nye kameraer og algoritmer, der markant øger hastigheden struktur bestemmelse af proteiner, der ikke let crystalize, især Membranproteiner. På trods af de seneste fremskridt i cryo-EM teknik forbliver forberedelse af renset proteiner tilstrækkelig kvalitet og mængde til at lette høj kvalitet billeddannelse ofte tidskrævende, dyrt og udfordrende. Evnen til hurtigt express og s…

Divulgazioni

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Vi takker G. Zhao og X. Meng for støtte med dataindsamling hos David Van Andel avanceret Cryo-Elektron Mikroskopi Suite. Vi værdsætter VARI High-Performance Computing teamet for computational støtte. Vi giver vores taknemmelighed til N. Clemente, D. afgifter, J. Floramo, Y. Huang, Y. Kim, C. Mueller, B. Roth og Z. Ruan for kommentarer, der i høj grad forbedret dette håndskrift. Vi takke D. Nadziejka for redaktionelle støtte til dette håndskrift. Dette arbejde blev støttet af indre VARI finansiering.

Materials

pEG BacMam vector (pFastBacI) addgene 31488
DH10α cells Life Technologies 10361-012
S.O.C. media Corning 46003CR for transformation of DH10α cells for Bacmid
Bacmam culture plates Teknova L5919 for culture of transformed DH10α cells
Incubation shaker for bacterial cells Infors HT Multitron standard
Incubated orbital shaker for insect cells Thermo-Fisher SHKE8000
Reach-in CO2 incubator for mammalian cells Thermo-Fisher 3951
Table-top orbital shaker Thermo-Fisher SHKE416HP used in Reach-in CO2 incubator for mammalian cells
Incubator VWR 1535 for bacterial plates
QIAprep Spin Miniprep Kit Qiagen 27106 for plasmid extraction and purification
Phenol:Chloroform:Isoamyl alcohol Invitrogen 15593031 for DNA extraction
Sf9 cells Life Technologies 12659017 insect cells for producing virus
Sf-900 media Gibco 12658-027 insect cell media
FBS Atlanta Biologicals S11550
Cellfectin II Gibco 10362100 for transfecting insect cells
lipofectamine 2000 Invitrogen 11668-027 for transfecting mamalian cells
0.2 mm syringe filter VWR 28145-501 for filtering P1 virus
0.2 mm filter flasks 500ml resevoir Corning 430758 for filtering P2 virus
erlenmeyer culture flask (flat bottom 2L) Gene Mate F-5909-2000 for culturing insect cells
erlenmeyer culture flask (baffled 2L) Gene Mate F-5909-2000B for culturing mammalian cells
nanodrop 2000 spectrophotometer Thermo-Fisher ND-2000 for determining DNA and protein concentrations
HEK293 ATCC CRL-3022 mammalian cells for producing protein
Freestyle 293 expression Medium Gibco 1238-018 mammalian cell media for protein expression
Butyric Acid Sodium Salt Acros 263195000 to amplify protein expression
PMSF Acros 215740500 protease inhibitor
Aprotinin from bovine lung Sigma-Aldrich A1153-100MG protease inhibitor
Leupeptin hydrochloride Sigma-Aldrich 24125-16-4 protease inhibitor
pepstatin A Fisher Scientific BP2671-250 protease inhibitor
digitonin EMD Millipore 300410 detergent – to solubilize protein from membrane
imidazole Sigma 792527 to elute protein from resin column
TALON resin Clonetech 635504 for affinity purification by His-tag
superose6 incease columns GE 29091596; 29091597 for HPLC and FPLC
Prominence Modular HPLC System Shimadzu See Below
Controller Module " CBM20A
Solvent Delivery System " LC30AD
Fluorescence Detector " RF20AXS
Autosampler with Cooling " SIL20ACHT
Pure FPLC System with Fractionator Akta
thrombin (alpha) Haematologic Technologies Incorporated HCT-0020 Human alpha for cleaving GFP tag
Amicon Ultra 15 mL 100K centrifugal filter tube Millipore UFC910008 for concentrating protein
EDTA Fisher E478500 for stabilizing protein
400 mesh carbon-coated copper grids Ted Pella Inc. 01754-F grids for negative stain
Quantifoil holey carbon grid (gold, 1.2/1.3 μm size/hole space, 300 mesh) Electron Microscopy Sciences Q3100AR1.3 grids for Cryo-EM
Vitrobot Mark III FEI for preparing sample grids by liquid ethane freezing
liquid nitrogen Dura-Cyl UN1977
ethane gas Airgas UN1035
Solarus Plasma System Gatan Model 950 for cleaning grids before sample freezing
Tecnai Spirit electron microscope FEI for negative stain EM imaging
Talos Arctica electron microsocope FEI for screening and low resolution imaging of Cryo-EM grids
Titan Krios electron microscope FEI for high-resolution Cryo-EM imaging
Software
Gautomatch software http://www.mrc-lmb.cam.ac.uk/kzhang/Gautomatch/ to pick particles from micrographs
Relion 2.1 software https://github.com/3dem/relion to construct 2D and 3D classification
CryoSPARC software https://cryosparc.com/ to generate an initial structure model
Frealign software http://grigoriefflab.janelia.org/frealign to refine particles
Coot software https://www2.mrc-lmb.cam.ac.uk/personal/pemsley/coot/ to build a model
MolProbity software http://molprobity.biochem.duke.edu/ to evaluate the geometries of the atomic model
SerialEM software http://bio3d.colorado.edu/SerialEM/ for automated serial image stack acquisition
MortionCor2 software http://msg.ucsf.edu/em/software/motioncor2.html for motion correction of summed movie stacks
GCTF software https://www.mrc-lmb.cam.ac.uk/kzhang/Gctf/ for measuring defocus values in movie stacks
Phenix.real_space_refine software https://www.phenix-online.org/documentation/reference/real_space_refine.html for real space refinement of the initial 3D model
DOWNLOAD MATERIALS LIST

Riferimenti

  1. Berridge, M. J., Bootman, M. D., Roderick, H. L. Calcium signalling: dynamics, homeostasis and remodelling. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 4 (7), 517-529 (2003).
  2. Kumar, R., Thompson, J. R. The regulation of parathyroid hormone secretion and synthesis. Journal of the American Society of Nephrology. 22 (2), 216-224 (2011).
  3. Sudhof, T. C. Calcium control of neurotransmitter release. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 4 (1), a011353 (2012).
  4. Ong, H. L., de Souza, L. B., Ambudkar, I. S. Role of TRPC Channels in Store-Operated Calcium Entry. Advances in Experimental Medicine and Biology. 898, 87-109 (2016).
  5. Smyth, J. T., et al. Activation and regulation of store-operated calcium entry. Journal of Cellular and Molecular Medicine. 14 (10), 2337-2349 (2010).
  6. Prakriya, M., Lewis, R. S. Store-Operated Calcium Channels. Physiological Reviews. 95 (4), 1383-1436 (2015).
  7. Liu, X., Singh, B. B., Ambudkar, I. S. TRPC1 is required for functional store-operated Ca2+ channels. Role of acidic amino acid residues in the S5-S6 region. Journal of Biological Chemistry. 278 (13), 11337-11343 (2003).
  8. Zhu, X., Jiang, M., Birnbaumer, L. Receptor-activated Ca2+ influx via human Trp3 stably expressed in human embryonic kidney (HEK)293 cells. Evidence for a non-capacitative Ca2+ entry. Journal of Biological Chemistry. 273 (1), 133-142 (1998).
  9. Zhu, X., et al. trp, a novel mammalian gene family essential for agonist-activated capacitative Ca2+ entry. Cell. 85 (5), 661-671 (1996).
  10. Itsuki, K., et al. Voltage-sensing phosphatase reveals temporal regulation of TRPC3/C6/C7 channels by membrane phosphoinositides. Channels (Austin). 6 (3), 206-209 (2012).
  11. Tang, J., et al. Identification of common binding sites for calmodulin and inositol 1,4,5-trisphosphate receptors on the carboxyl termini of trp channels. Journal of Biological Chemistry. 276 (24), 21303-21310 (2001).
  12. Gonzalez-Cobos, J. C., Trebak, M. TRPC channels in smooth muscle cells. Frontiers in Bioscience (Landmark Edition). 15, 1023-1039 (2010).
  13. Li, H. S., Xu, X. Z., Montell, C. Activation of a TRPC3-dependent cation current through the neurotrophin BDNF). Neuron. 24 (1), 261-273 (1999).
  14. Becker, E. B., et al. Candidate screening of the TRPC3 gene in cerebellar ataxia. Cerebellum. 10 (2), 296-299 (2011).
  15. Kitajima, N., et al. TRPC3 positively regulates reactive oxygen species driving maladaptive cardiac remodeling. Scientific Reports. 6, 37001 (2016).
  16. Yang, S. L., Cao, Q., Zhou, K. C., Feng, Y. J., Wang, Y. Z. Transient receptor potential channel C3 contributes to the progression of human ovarian cancer. Oncogene. 28 (10), 1320-1328 (2009).
  17. Oda, K., et al. Transient receptor potential cation 3 channel regulates melanoma proliferation and migration. Journal of Physiological Sciences. 67 (4), 497-505 (2017).
  18. Xia, M., Liu, D., Yao, C. TRPC3: A New Target for Therapeutic Strategies in Chronic Pain-DAG-mediated Activation of Non-selective Cation Currents and Chronic Pain (Mol Pain 2014;10:43). Journal of Neurogastroenterology and Motility. 21 (3), 445-447 (2015).
  19. Fan, C., Choi, W., Sun, W., Du, J., Lu, W. Structure of the human lipid-gated cation channel TRPC3. Elife. 7, e36852 (2018).
  20. Goehring, A., et al. Screening and large-scale expression of membrane proteins in mammalian cells for structural studies. Nature Protocols. 9 (11), 2574-2585 (2014).
  21. Hattori, M., Hibbs, R. E., Gouaux, E. A fluorescence-detection size-exclusion chromatography-based thermostability assay to identify membrane protein expression and crystallization conditions. Structure (London, England: 1993). 20 (8), 1293-1299 (2012).
  22. Zheng, S. Q., et al. MotionCor2: anisotropic correction of beam-induced motion for improved cryo-electron microscopy. Nature Methods. 14 (4), 331-332 (2017).
  23. Zhang, K. Gctf: Real-time CTF determination and correction. Journal of Structural Biology. 193 (1), 1-12 (2016).
  24. Scheres, S. H. RELION: implementation of a Bayesian approach to cryo-EM structure determination. Journal of Structural Biology. 180 (3), 519-530 (2012).
  25. Punjani, A., Rubinstein, J. L., Fleet, D. J., Brubaker, M. A. cryoSPARC: algorithms for rapid unsupervised cryo-EM structure determination. Nature Methods. 14 (3), 290-296 (2017).
  26. Grigorieff, N. Frealign: An Exploratory Tool for Single-Particle Cryo-EM. Methods in Enzymology. 579, 191-226 (2016).
  27. Emsley, P., Lohkamp, B., Scott, W. G., Cowtan, K. Features and development of Coot. Acta Crystallographica Section D: Biological Crystallography. 66 (Pt 4), 486-501 (2010).
  28. Afonine, P. V., et al. Towards automated crystallographic structure refinement with phenix.refine. Acta Crystallographica Section D: Biological Crystallography. 68 (Pt 4), 352-367 (2012).
  29. Chen, V. B., et al. MolProbity: all-atom structure validation for macromolecular crystallography. Acta Crystallographica Section D: Biological Crystallography. 66 (Pt 1), 12-21 (2010).
  30. Scheres, S. H. W., Chen, S. Prevention of overfitting in cryo-EM structure determination. Nature Methods. 9 (9), 853-854 (2012).
  31. Scheres, S. H. W. RELION: Implementation of a Bayesian approach to cryo-EM structure determination. Journal of Structural Biology. 180 (3), 519-530 (2012).
  32. Grigorieff, N. Frealign: An Exploratory Tool for Single-Particle Cryo-EM. Methods in Enzymology. 579, 191-226 (2016).
  33. Chen, V. B., et al. MolProbity: all-atom structure validation for macromolecular crystallography. Acta Crystallographica Section D-Biological Crystallography. 66, 12-21 (2010).
  34. Emsley, P., Lohkamp, B., Scott, W. G., Cowtan, K. Features and development of Coot. Acta Crystallographica Section D-Biological Crystallography. 66, 486-501 (2010).
  35. Green, E. M., Au, Thermostabilization, Expression, Purification, and Crystallization of the Human Serotonin Transporter Bound to S-citalopram. Journal of Visualized Experiments. (117), e54792 (2016).
  36. Mesa, P., Deniaud, A., Montoya, G., Schaffitzel, C. Directly from the source: endogenous preparations of molecular machines. Current Opinion in Structural Biology. 23 (3), 319-325 (2013).
  37. Bayburt, T. H., Sligar, S. G. Membrane Protein Assembly into Nanodiscs. FEBS letters. 584 (9), 1721-1727 (2010).
  38. Winkler, P. A., Huang, Y., Sun, W., Du, J., Lü, W. Electron cryo-microscopy structure of a human TRPM4 channel. Nature. 552, 200-204 (2017).
  39. Autzen, H. E., et al. Structure of the human TRPM4 ion channel in a lipid nanodisc. Science. 359 (6372), 228-232 (2017).
  40. Guo, J., et al. Structures of the calcium-activated, non-selective cation channel TRPM4. Nature. 552 (7684), 205-209 (2017).
  41. Parmar, M., et al. Using a SMALP platform to determine a sub-nm single particle cryo-EM membrane protein structure. Biochimica et Biophysica Acta (BBA)-Biomembranes. 1860 (2), 378-383 (2018).
  42. Gulati, S., et al. Detergent-free purification of ABC (ATP-binding-cassette) transporters. Biochemical Journal. 461 (2), 269-278 (2014).

Tags

TRPC3Ion ChannelProtein ExpressionProtein PurificationSingle-particle Cryo-electron MicroscopyHEK293 CellsVirus InfectionSodium ButyrateDetergent SolubilizationSize-exclusion ChromatographyUltracentrifugation
check_url/it/58754?article_type=t

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Citazione di questo articolo
Haley, E., Choi, W., Fan, C., Sun, W., Du, J., Lü, W. Expression and Purification of the Human Lipid-sensitive Cation Channel TRPC3 for Structural Determination by Single-particle Cryo-electron Microscopy. J. Vis. Exp. (143), e58754, doi:10.3791/58754 (2019).
Scarica citazione
Ristampe e autorizzazioni

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image