मानव लिपिड के प्रति संवेदनशील कटियन चैनल TRPC3 के एकल कण क्रायो-इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी द्वारा संरचनात्मक निर्धारण के लिए अभिव्यक्ति और शुद्धि
Summary
इस प्रोटोकॉल क्रायो-इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी द्वारा आयन चैनल संरचनाओं का निर्धारण करने के लिए इस्तेमाल तकनीक का वर्णन करता है, एक baculovirus प्रणाली कुशलतापूर्वक न्यूनतम प्रयास और विषाक्तता, प्रोटीन निष्कर्षण, शुद्धि के साथ स्तनधारी कोशिकाओं में जीन व्यक्त करने के लिए इस्तेमाल किया सहित, और गुणवत्ता की जांच, नमूना ग्रिड तैयारी और स्क्रीनिंग, साथ ही साथ डेटा संग्रह और प्रसंस्करण ।
Abstract
विहित टीआरपी उपपरिवार के क्षणिक रिसेप्टर संभावित चैनलों (TRPCs) जो कैल्शियम homeostasis में एक आवश्यक भूमिका निभाते हैं, विशेष रूप से स्टोर संचालित कैल्शियम प्रवेश, जो उचित समारोह को बनाए रखने के लिए महत्वपूर्ण है गैर कटियन चैनल हैं synaptic पुटिका रिलीज और intracellular संकेतन मार्ग । तदनुसार, TRPC चैनलों को हृदय संबंधी विकारों जैसे कार्डियक अतिवृद्धि, neurodegenerative विकारों जैसे पार्किंसंस रोग, और neurologic विकारों जैसे spinocerebellar गतिभंग सहित मानव रोगों की एक किस्म में फंसाया गया है. इसलिए, TRPC चैनल मानव रोगों में एक संभावित औषधीय लक्ष्य का प्रतिनिधित्व करते हैं । बहरहाल, इन चैनलों में गेटिंग का आणविक तंत्र अभी भी अस्पष्ट है. स्थिर, सजातीय, और शुद्ध प्रोटीन की बड़ी मात्रा में प्राप्त करने में कठिनाई संरचना निर्धारण अध्ययन में एक सीमित कारक है, विशेष रूप से स्तनधारी झिल्ली प्रोटीन के लिए ऐसे TRPC आयन चैनल के रूप में किया गया है । यहां, हम स्तनधारी आयन चैनल झिल्ली प्रोटीन के बड़े पैमाने पर अभिव्यक्ति के लिए एक प्रोटोकॉल वर्तमान एक संशोधित baculovirus जीन स्थानांतरण प्रणाली का उपयोग और समानता और आकार-अपवर्जन क्रोमैटोग्राफी द्वारा इन प्रोटीन की शुद्धि । हम आगे शुद्ध प्रोटीन से एकल कण क्रायो-इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी छवियों को इकट्ठा करने के लिए और प्रोटीन संरचना का निर्धारण करने के लिए इन छवियों का उपयोग करने के लिए एक प्रोटोकॉल पेश करते हैं । संरचना निर्धारण आयन चैनलों में गेटिंग और समारोह के तंत्र को समझने के लिए एक शक्तिशाली तरीका है ।
Introduction
कैल्शियम सिग्नलिंग कैस्केडिंग, प्रतिलेखन नियंत्रण, न्यूरोट्रांसमीटर रिलीज़, और हार्मोन अणु संश्लेषण1,2,3सहित सबसे सेलुलर प्रक्रियाओं में शामिल है. cytosolic मुक्त कैल्शियम के समस्थिति रखरखाव के स्वास्थ्य और कोशिकाओं के समारोह के लिए महत्वपूर्ण है । intracellular कैल्शियम homeostasis के प्रमुख तंत्र में से एक स्टोर संचालित कैल्शियम प्रविष्टि (SOCE), एक प्रक्रिया है जिसमें कैल्शियम की कमी endoplasmic जालिका (एर) में संग्रहीत प्लाज्मा झिल्ली पर आयन चैनलों के उद्घाटन से चलाता है की सुविधा फिर4,5,6संकेतन में इस्तेमाल किया जा सकता है, जो एर कैल्शियम की भरपाई । क्षणिक रिसेप्टर संभावित चैनल (TRPCs), जो कैल्शियम-पारगंय टीआरपी superfamily से संबंधित चैनल हैं, SOCE7,8,9 में एक प्रमुख भागीदार के रूप में पहचान की गई है ।
TRPC परिवार में सात सदस्यों के अलावा, TRPC3, TRPC6, और TRPC7 एक homologue उपसमूह के रूप में, और वे लिपिड माध्यमिक दूत diacylglycerol (तमंचा), संकेतन लिपिड के एक गिरावट उत्पाद द्वारा सक्रिय किया जा करने की क्षमता में अद्वितीय हैं phosphatidylinositol ४, ५-bisphosphate (PIP2)१०,११. TRPC3 अत्यधिक चिकनी मांसपेशियों में और मस्तिष्क और अनुमस्तिष्क क्षेत्रों में व्यक्त की है, जहां यह कैल्शियम संकेत है कि प्रभाव neurotransmission और neurogenesis12,13में आवश्यक भूमिका निभाता है । TRPC3 की शिथिलता केंद्रीय तंत्रिका तंत्र विकारों, हृदय विकारों, और कुछ ऐसे डिम्बग्रंथि ग्रंथिकर्कटता14,15,16के रूप में कैंसर के लिए जोड़ा गया है । इसलिए, TRPC3 इन रोगों के उपचार के लिए एक दवा लक्ष्य के रूप में वादा रखती है । विशेष रूप से लक्षित TRPC3 पर अभिनय दवाओं के विकास के अपने आणविक सक्रियकरण तंत्र की समझ की कमी के द्वारा सीमित किया गया है, लिपिड बाइंडिंग साइटों सहित17,18. हम मानव TRPC3 चैनल के पहले परमाणु-संकल्प संरचना की सूचना दी है (hTRPC3) और उसके दो एक बंद राज्य में लिपिड बाध्यकारी साइटों, इन तंत्र19में महत्वपूर्ण अंतर्दृष्टि प्रदान करते हैं ।
उच्च संकल्प पर एक झिल्ली प्रोटीन की संरचना का निर्धारण करने के लिए महत्वपूर्ण कारक उच्च गुणवत्ता के प्रोटीन प्राप्त करने के लिए है । अभिव्यक्ति और शुद्धि के लिए उच्च गुणवत्ता वाले प्रोटीन प्राप्त करने के लिए आवश्यक शर्तों के इसी स्क्रीनिंग एक समय लेने वाली और महंगा प्रयास किया जा सकता है । यहां हम एक विस्तार से वर्णन प्रोटोकॉल कैसे हम अभिव्यक्ति और hTRPC3, जो हमारे प्रारंभिक स्क्रीनिंग में खराब बर्ताव की शुद्धि के लिए इष्टतम स्थितियों की पहचान प्रस्तुत करते हैं । हम कैसे समस्या निवारण और प्रोटीन व्यवहार है, जो हमारे क्रायो-इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (क्रायो-EM) के अध्ययन के लिए एक ठोस आधार रखना अनुकूलन पर कई प्रमुख बिंदुओं वर्तमान । हम एक संशोधित baculoviral उत्पादन सदिश का उपयोग करें (खूंटी), Gouaux और सहकर्मियों द्वारा विकसित, जो स्क्रीनिंग परख और स्तनधारी कोशिकाओं में baculovirus के कुशल पीढ़ी के लिए अनुकूलित है20। इस अभिव्यक्ति विधि स्तनधारी कोशिका झिल्ली में प्रोटीन की तेजी से और लागत प्रभावी व्यक्त करने के लिए उपयुक्त है । हम इस वेक्टर के उपयोग को प्रतिदीप्ति-डिटेक्शन आकार-बहिष्करण क्रोमैटोग्राफी-आधारित (FSEC) विधि21के साथ संयोजित करते हैं । इस विधि का उपयोग करता है एक ग्रीन फ्लोरोसेंट प्रोटीन (GFP) टैग हित के निर्माण से जुड़े और छोटे, पूरे सेल solubilized नमूनों में लक्ष्य प्रोटीन के दृश्य में सुधार । यह अलग डिटर्जेंट और additives की उपस्थिति में प्रोटीन स्थिरता की स्क्रीनिंग के लिए अनुमति देता है, thermostabilizing उत्परिवर्तनों के साथ, और छोटे पैमाने पर क्षणिक अभिकर्मक से कोशिकाओं की एक छोटी संख्या के उपयोग की अनुमति देता है । इस तरह बड़े पैमाने पर प्रोटीन शुद्धिकरण के लिए जाने से पहले स्थितियों की एक भीड़ तेजी से दिखलाई जा सकती है । अभिव्यक्ति के बाद, स्क्रीनिंग, और शुद्धि, हम क्रायो से छवियों को प्राप्त करने और प्रसंस्करण के लिए एक प्रोटोकॉल वर्तमान प्रोटीन की एक डी नोवो संरचनात्मक निर्धारण उत्पंन करने के लिए । हमें विश्वास है कि यहां वर्णित दृष्टिकोण टीआरपी चैनल रिसेप्टर्स और अंय झिल्ली प्रोटीन के संरचनात्मक अध्ययन के लिए एक सामांय प्रोटोकॉल के रूप में काम करेंगे ।
Protocol
Representative Results
Discussion
क्रायो द्वारा प्रोटीन के संरचनात्मक निर्धारण-EM पिछले कुछ वर्षों में संरचनात्मक जीव विज्ञान के क्षेत्र में क्रांति आई है, नए कैमरों और एल्गोरिदम के विकास के लिए धंयवाद है कि काफी ऊपर प्रोटीन है कि नहीं …
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
हम डेविड वान Andel उंनत क्रायो-इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी सुइट में डेटा संग्रह के साथ समर्थन के लिए जी Zhao और एक्स मेंग धंयवाद । हम गणना के समर्थन के लिए वारी उच्च प्रदर्शन कंप्यूटिंग टीम की सराहना करते हैं । हम N. क्लेमेंट, डी. बकाया राशि, जे Floramo, वाई हुआंग, वाई किम, सी. ंयूएलर, बी. रोथ, और जेड Ruan टिप्पणी है कि बहुत इस पांडुलिपि में सुधार के लिए हमारे आभार देते हैं । हम इस पांडुलिपि के लिए संपादकीय समर्थन के लिए Nadziejka धंयवाद । इस काम को इंटरनल वारी फंडिंग ने सपोर्ट किया था ।
Materials
| pEG BacMam vector (pFastBacI) | addgene | 31488 | |
| DH10α cells | Life Technologies | 10361-012 | |
| S.O.C. media | Corning | 46003CR | for transformation of DH10α cells for Bacmid |
| Bacmam culture plates | Teknova | L5919 | for culture of transformed DH10α cells |
| Incubation shaker for bacterial cells | Infors HT | Multitron standard | |
| Incubated orbital shaker for insect cells | Thermo-Fisher | SHKE8000 | |
| Reach-in CO2 incubator for mammalian cells | Thermo-Fisher | 3951 | |
| Table-top orbital shaker | Thermo-Fisher | SHKE416HP | used in Reach-in CO2 incubator for mammalian cells |
| Incubator | VWR | 1535 | for bacterial plates |
| QIAprep Spin Miniprep Kit | Qiagen | 27106 | for plasmid extraction and purification |
| Phenol:Chloroform:Isoamyl alcohol | Invitrogen | 15593031 | for DNA extraction |
| Sf9 cells | Life Technologies | 12659017 | insect cells for producing virus |
| Sf-900 media | Gibco | 12658-027 | insect cell media |
| FBS | Atlanta Biologicals | S11550 | |
| Cellfectin II | Gibco | 10362100 | for transfecting insect cells |
| lipofectamine 2000 | Invitrogen | 11668-027 | for transfecting mamalian cells |
| 0.2 mm syringe filter | VWR | 28145-501 | for filtering P1 virus |
| 0.2 mm filter flasks 500ml resevoir | Corning | 430758 | for filtering P2 virus |
| erlenmeyer culture flask (flat bottom 2L) | Gene Mate | F-5909-2000 | for culturing insect cells |
| erlenmeyer culture flask (baffled 2L) | Gene Mate | F-5909-2000B | for culturing mammalian cells |
| nanodrop 2000 spectrophotometer | Thermo-Fisher | ND-2000 | for determining DNA and protein concentrations |
| HEK293 | ATCC | CRL-3022 | mammalian cells for producing protein |
| Freestyle 293 expression Medium | Gibco | 1238-018 | mammalian cell media for protein expression |
| Butyric Acid Sodium Salt | Acros | 263195000 | to amplify protein expression |
| PMSF | Acros | 215740500 | protease inhibitor |
| Aprotinin from bovine lung | Sigma-Aldrich | A1153-100MG | protease inhibitor |
| Leupeptin hydrochloride | Sigma-Aldrich | 24125-16-4 | protease inhibitor |
| pepstatin A | Fisher Scientific | BP2671-250 | protease inhibitor |
| digitonin | EMD Millipore | 300410 | detergent – to solubilize protein from membrane |
| imidazole | Sigma | 792527 | to elute protein from resin column |
| TALON resin | Clonetech | 635504 | for affinity purification by His-tag |
| superose6 incease columns | GE | 29091596; 29091597 | for HPLC and FPLC |
| Prominence Modular HPLC System | Shimadzu | See Below | |
| Controller Module | " | CBM20A | |
| Solvent Delivery System | " | LC30AD | |
| Fluorescence Detector | " | RF20AXS | |
| Autosampler with Cooling | " | SIL20ACHT | |
| Pure FPLC System with Fractionator | Akta | ||
| thrombin (alpha) | Haematologic Technologies Incorporated | HCT-0020 Human alpha | for cleaving GFP tag |
| Amicon Ultra 15 mL 100K centrifugal filter tube | Millipore | UFC910008 | for concentrating protein |
| EDTA | Fisher | E478500 | for stabilizing protein |
| 400 mesh carbon-coated copper grids | Ted Pella Inc. | 01754-F | grids for negative stain |
| Quantifoil holey carbon grid (gold, 1.2/1.3 μm size/hole space, 300 mesh) | Electron Microscopy Sciences | Q3100AR1.3 | grids for Cryo-EM |
| Vitrobot Mark III | FEI | for preparing sample grids by liquid ethane freezing | |
| liquid nitrogen | Dura-Cyl | UN1977 | |
| ethane gas | Airgas | UN1035 | |
| Solarus Plasma System | Gatan | Model 950 | for cleaning grids before sample freezing |
| Tecnai Spirit electron microscope | FEI | for negative stain EM imaging | |
| Talos Arctica electron microsocope | FEI | for screening and low resolution imaging of Cryo-EM grids | |
| Titan Krios electron microscope | FEI | for high-resolution Cryo-EM imaging | |
| Software | |||
| Gautomatch software | http://www.mrc-lmb.cam.ac.uk/kzhang/Gautomatch/ | to pick particles from micrographs | |
| Relion 2.1 software | https://github.com/3dem/relion | to construct 2D and 3D classification | |
| CryoSPARC software | https://cryosparc.com/ | to generate an initial structure model | |
| Frealign software | http://grigoriefflab.janelia.org/frealign | to refine particles | |
| Coot software | https://www2.mrc-lmb.cam.ac.uk/personal/pemsley/coot/ | to build a model | |
| MolProbity software | http://molprobity.biochem.duke.edu/ | to evaluate the geometries of the atomic model | |
| SerialEM software | http://bio3d.colorado.edu/SerialEM/ | for automated serial image stack acquisition | |
| MortionCor2 software | http://msg.ucsf.edu/em/software/motioncor2.html | for motion correction of summed movie stacks | |
| GCTF software | https://www.mrc-lmb.cam.ac.uk/kzhang/Gctf/ | for measuring defocus values in movie stacks | |
| Phenix.real_space_refine software | https://www.phenix-online.org/documentation/reference/real_space_refine.html | for real space refinement of the initial 3D model |
Riferimenti
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