회전 디스크-총 내부 반사 형광 현미경 검사 법 고급 시각화에 의해 세포 접착 형성
Summary
신속 하 고 높은 해상도 허용 하는 고급 현미경, 고립 된 플라즈마 멤브레인와 주변 세포내 볼륨의 이미지를 제시 한다. 회전 디스크 및 총 내부 반사 형광 현미경 검사 법 한 설정의 통합 3.5까지 높은 수집 속도에서 라이브 이미징 실험을 허용 이미지 스택 당 s.
Abstract
살아있는 세포에 접착 형성 등 프로세스 원형질 막과 세포 내부에 광범위 한 변화를 포함 한다. 이러한 높은 동적 이벤트를 시각화 하기 위해 라이브 샘플의 빠른 이미지를 허용 하는 두 가지 보완 가벼운 현미경 검사 법 기술을 결합 했다: 회전 하는 디스크 현미경 (SD) 및 고해상도 볼륨 녹음 및 총 내부 반사 형광 (TIRF) 정확한 현지화 및 원형질 막의 시각화에 대 한 현미경 검사 법 포괄적이 고 완전 한 이미징 프로토콜 샘플 준비, 현미경 교정, 이미지 형성 및 취득 안내, 다 색 SD TIRF 라이브 이미징 시리즈 높은 spatio 시간적 해상도 결과 대 한 표시 됩니다. 모든 필요한 이미지 후 처리 단계 다차원 라이브 이미징 데이터 집합, 즉 등록 및 개별 채널의 조합 생성 ImageJ의 오픈 소스 소프트웨어에 대 한 자체 서 면된 매크로에 제공 됩니다. 개시 동안 형광 단백질의 이미징 및 접착 단지의 성숙 뿐만 아니라 말라 cytoskeletal 네트워크의 형성이 새로운 접근에 대 한 원리의 증거로 사용 되었다. 셀룰러 환경에서 하 고, 동시에, 높은 감지 막 관련 된 분자의 정확한 지 방화에 이러한 복잡 한 프로세스에 대 한 자세한 설명을 제공 하는 높은 해상도 3D 현미경 및 TIRF의 조합 신호-배경 비율입니다.
Introduction
우리의 일, 가벼운 현미경 검사 법 기술 고정에 높은/슈퍼 해상도 이미징 및 살아있는 견본을 제공 하는 급속 하 게 개발 하고있다. 와 같은 슈퍼 해상도 기법 자극 방출 소모 (호텔 위치), 구조화 조명 현미경 (SIM) 및 사진 활성화 지역화 현미경 (팜) 또는 직접 확률적 광학 재건 현미경 (폭풍), 각각, 있다 상업적으로 사용할 수 있는 활성화의 subcellular 구조는 분자 규모1,2,3,4,,56에 거의 정보를 보여주는 영상. 그러나,이 접근 아직도 있는 대용량 두 번째 수집 속도 여러 프레임 구상 될 필요가 라이브 이미징 실험에 대 한 적용을 제한 했다. 원형질 막, 예를 들어 엔도-를 통해 규제 하는 매우 동적 프로세스의 다양성 / exocytosis, 접착, 마이그레이션 또는 신호, 고속 대용량 세포 내에서 발생. 최근,이 격차를 채우기 위해 통합된 현미경 검사 법 기술이 했다 제안된 라는 회전 디스크-TIRF (SD-TIRF)7. 자세하게, TIRF 현미경 특별히 분리와 원형질 막8,9지역화, SD 현미경 검사 법은 가장 중요 한 중 하나 빠른 라이브 이미징 기술을 시각화 및 추적에 대 한 허용 세포질10,11subcellular 세포. 그러나 단일 설치에 두 이미징 기술 조합 지난12,13에서 이미 실현 되어,, (그림 1)을 여기에 제시 된 현미경은 마침내 라이브 이미징 SD TIRF 실험을 수행 하 기준을 충족합니다 두 번째 속도 초당 3 프레임에서 상기 프로세스. 이 현미경 상업적으로 사용할 수 있기 때문에,이 원고의 목표 세부 사항에서 설명 하는 이미지 수집, 등록, 및 시각화 SD TIRF 현미경과 관련 된 오픈 소스 도구와 프로토콜을 제공입니다.
설치는 독립 포트를 통해 두 검색 단위에 연결 된 거꾸로 한 현미경 기반-왼쪽된 포트 TIRF와 사진-정품 인증/표백 SD 장치 및 스캐너 장치를 후면 포트에 연결 되어 실험. 최대 6 레이저 (405/445/488/515/561/640 nm) 여기에 사용할 수 있습니다. 여기 및 형광 신호, 어느 100 x의 탐지 / NA1.45 기름이 나 60 x / NA1.49 오일 TIRF 목표, 각각, 고용 되어 있다. 내보낸된 빛 dichroic 거울 (561 nm 긴 통과 또는 514 nm 긴 패스)에 의해 분할과 다양 한 대역 통과 필터에 의해 필터링 (55 nm 넓은 중심으로 525 nm, 54 nm 넓은 가운데 609에 녹색과 적색 형광에 대 한 nm 각각) 두 EM-CCD 카메라 앞 시대입니다. Zobiak 외 에 설치에 대 한 더 많은 기술적인 세부 사항 나열 된 note 하시기 바랍니다 7. TIRF 구성에서 SD 단위 0.5 경 내에서 가벼운 경로에서 이동 s 검색 동일한 두 카메라를 사용할 수 있도록 1 년경에 비해 두 이미징 형식 사이의 빠른 전환 수 있도록 과거에 보고 된 s13 . 이 기능을 통해 듀얼-채널 동시 수집, 따라서 4 채널 SD TIRF 이미징 이전에 최고 속도 및 정확성을 수행할 수 있습니다. 또한, SD 및 TIRF 이미지 사이의 정렬 필요 하지 않습니다. 하지만 두 카메라 사이의 이미지 정렬, 실험을 시작 하기 전에 확인 하 고 필요한 경우 수정 있다. 다음 프로토콜에서 등록 수정 루틴 자체 서 면된 ImageJ 매크로에 구현 되었습니다. 또한, 매크로 주로 SD-및 그들의 다른 차원에도 불구 하 고 데이터 집합 TIRF의 동시 시각화 수 있도록 설계 되었습니다. 수집 소프트웨어 자체는 이러한 기능을 제공 하지 않았다.
Protocol
Representative Results
Discussion
이 문서에서 라이브 셀 이미징 실험, 즉 높은 수집 속도 3 다른 단계에 분당 2 SD TIRF 이미지 스택 등을 수행 하기 위한 적절 한 구성에서 SD 및 TIRF 현미경의 첫번째 성공적인 구현을 제시 했다 위치, 해당 총 168 프레임 (약 3 프레임 / 초), 하 인수 했다. 했다 몇 SD TIRF 현미경12,13, 주로는 3D에서 세포 프로세스에 따라 충분히 높은 이미징 속도의 부족을…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
우리는 크게 과학계를의 대학 의료 센터 함부르크-Eppendorf 샘플을 평가 대 한 우리를 지원 하기 위한 감사 합니다. 즉, 우리 사 빈 Windhorst NIH3T3 세포, YFP-Vinculin에 대 한 안드레아 Mordhorst와 RFP Lifeact에 대 한 마 렌 루돌프에 대 한 감사합니다.
Materials
| Microscope and accessories | |||
| SD-TIRF microscope | Visitron Systems | ||
| Ti with perfect focus system | Nikon | Inverted microscope stand | |
| CSU-W1 T2 | Yokogawa | Spinning disk unit in dual-camera configuration | |
| iLAS2 | Roper Scientific | TIRF/FRAP scanner | |
| Evolve | Photometrix | EM-CCD cameras | |
| PiezoZ stage | Ludl Electronic Products | Motorized Z stage | |
| Bioprecision2 XY stage | Ludl Electronic Products | Motorized XY stage | |
| Stage top incubation chamber | Okolab | Bold Line | Temperature, CO2 and humidity supply |
| Cell culture | |||
| HeLa cervical cancer cells | DSMZ | ACC-57 | |
| NIH3T3 fibroblasts | DSMZ | ACC-59 | |
| Dulbecco's phosphate buffered saline (PBS) | Gibco | 14190144 | |
| Trypsin-EDTA 0.05% | Gibco | 25300054 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium + GlutaMAX-I (DMEM) | Gibco | 31966-021 | |
| OptiMEM | Gibco | 31985070 | Reduced serum medium |
| Fetal calf serum (FCS) | Gibco | 10500064 | |
| Penicillin/Streptomycin (PenStrep) | Gibco | 15140148 | |
| Full growth medium (DMEM supplemented with 10% FCS and 1% PenStrep) | |||
| TurboFect | ThermoFisher Scientific | R0531 | Transfection reagent |
| Ascorbic acid (AA) | Sigma | A544-25G | |
| 6-well cell culture plate | Sarstedt | 83.392 | |
| Glass bottom dishes | MatTek | P35G-1.5-10-C | 35mm, 0.17mm glass coverslip |
| Fibronectin, bovine plasma | ThermoFisher Scientific | 33010018 | |
| Neubauer improved chamber | VWR | 631-0696 | |
| TetraSpeck beads | ThermoFisher Scientific | T7279 | |
| Plasmids | |||
| RFP-Lifeact | Maren Rudolph, Institute of Medical Microbiology, University Medical Center Hamburg Eppendorf, Germany | ||
| YFP-Vinculin | Andrea Mordhorst, Institute of Medical Microbiology, University Medical Center Hamburg Eppendorf, Germany | ||
| Software and plugins | |||
| VisiView | Visitron Systems | Version 3 | |
| ImageJ | Version 1.52c | ||
| Turboreg plugin | http://bigwww.epfl.ch/thevenaz/turboreg/ | ||
| Macro "SD-TIRF_helper_JoVE.ijm" | this publication | https://github.com/bzobiak/ImageJ | |
| Volocity | PerkinElmer | Version 6.2.2 |
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