उन्नत कताई डिस्क के माध्यम से कोशिकाओं में आसंजन गठन visualizing-कुल आंतरिक प्रतिबिंब प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी
Summary
एक उंनत माइक्रोस्कोप कि दोनों के तेज और उच्च संकल्प इमेजिंग की अनुमति, अलग प्लाज्मा झिल्ली और आसपास के intracellular मात्रा, प्रस्तुत किया जाएगा । एक सेटअप में डिस्क कताई और कुल आंतरिक प्रतिबिंब प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी के एकीकरण उच्च अधिग्रहण की दर पर लाइव इमेजिंग प्रयोगों की अनुमति देता है छवि स्टैक प्रति ३.५ s करने के लिए ।
Abstract
जीवित कोशिकाओं में, आसंजन गठन जैसे प्रक्रियाओं प्लाज्मा झिल्ली और सेल इंटीरियर में व्यापक संरचनात्मक परिवर्तन शामिल हैं । इन अत्यधिक गतिशील घटनाओं कल्पना करने के लिए, दो पूरक प्रकाश माइक्रोस्कोपी तकनीक है कि जीने के नमूनों की तेजी से इमेजिंग की अनुमति संयुक्त थे: तेज और उच्च संकल्प मात्रा रिकॉर्डिंग और कुल आंतरिक प्रतिबिंब के लिए कताई डिस्क माइक्रोस्कोपी (एसडी) प्रतिदीप्ति (TIRF) सटीक स्थानीयकरण और प्लाज्मा झिल्ली के दृश्य के लिए माइक्रोस्कोपी । एक व्यापक और पूर्ण इमेजिंग प्रोटोकॉल नमूना तैयारी, माइक्रोस्कोप अंशांकन, छवि गठन और अधिग्रहण, उच्च spatio-लौकिक संकल्प के साथ बहु रंग एसडी TIRF लाइव इमेजिंग श्रृंखला में जिसके परिणामस्वरूप के माध्यम से मार्गदर्शन के लिए दिखाया जाएगा । बहु-आयामी लाइव इमेजिंग डेटासेट उत्पन्न करने के लिए सभी आवश्यक छवि पोस्ट-प्रोसेसिंग कदम, अर्थात पंजीकरण और व्यक्तिगत चैनलों के संयोजन, खुले स्रोत सॉफ्टवेयर ImageJ के लिए एक स्व-लिखित मैक्रो में प्रदान की जाती हैं । दीक्षा और आसंजन परिसरों की परिपक्वता के दौरान फ्लोरोसेंट प्रोटीन की इमेजिंग, साथ ही साथ actin cytoskeletal नेटवर्क के गठन, इस उपंयास दृष्टिकोण के लिए सिद्धांत का एक सबूत के रूप में इस्तेमाल किया गया था । उच्च संकल्प 3 डी माइक्रोस्कोपी और TIRF के संयोजन सेलुलर वातावरण के भीतर इन जटिल प्रक्रियाओं का एक विस्तृत विवरण प्रदान की है और, एक ही समय में, एक उच्च के साथ पता चला झिल्ली से जुड़े अणुओं की सटीक स्थानीयकरण संकेत करने वाली पृष्ठभूमि अनुपात ।
Introduction
हमारे दिन, प्रकाश माइक्रोस्कोपी उपलब्ध कराने की तकनीक उच्च/सुपर संकल्प इमेजिंग स्थिर और रहने वाले नमूने में तेजी से विकसित कर रहे हैं । इस तरह के रूप में उत्तेजित उत्सर्जन घट (STED), संरचित दीप्ति माइक्रोस्कोपी (सिम) और फोटो-सक्रियण स्थानीयकरण माइक्रोस्कोपी (पाम) या प्रत्यक्ष stochastic ऑप्टिकल पुनर्निर्माण माइक्रोस्कोपी (तूफान) के रूप में सुपर संकल्प तकनीक, क्रमशः कर रहे हैं व्यावसायिक रूप से उपलब्ध है और सेलुलर संरचनाओं की इमेजिंग सक्षम लगभग आणविक पैमाने पर विवरण दिखा1,2,3,4,5,6। हालांकि, इन approaches अभी भी सीमित करने के लिए लाइव इमेजिंग प्रयोगों जिसमें बड़ी मात्रा में एकाधिक फ़्रेम प्रति सेकंड प्राप्ति की गति के साथ विज़ुअलाइज़ करने की आवश्यकता है । अत्यधिक गतिशील प्लाज्मा झिल्ली के माध्यम से विनियमित प्रक्रियाओं की किस्मों, जैसे इंडो-/exocytosis, आसंजन, प्रवास या संकेतन, बड़े सेलुलर संस्करणों के भीतर उच्च गति के साथ होते हैं । हाल ही में, आदेश में इस अंतर को भरने के लिए, एक एकीकृत माइक्रोस्कोपी तकनीक का प्रस्ताव किया गया था कताई डिस्क-TIRF (एसडी-TIRF)7। विस्तार में, विशेष रूप से अलग करने के लिए TIRF माइक्रोस्कोपी परमिट और प्लाज्मा झिल्ली स्थानीयकरण8,9, जबकि एसडी माइक्रोस्कोपी के दृश्य और ट्रैकिंग के लिए सबसे संवेदनशील और तेजी से लाइव इमेजिंग तकनीकों में से एक है कोशिका द्रव्य10,11में सेल् फी organelles । एक सेटअप में दोनों इमेजिंग तकनीकों का संयोजन पहले से ही पिछले12,13में महसूस किया गया है, तथापि, माइक्रोस्कोप यहां प्रस्तुत (1 आंकड़ा) अंत में मानदंडों को पूरा करने के लिए लाइव इमेजिंग एसडी-TIRF प्रयोगों प्रदर्शन aforementioned प्रक्रियाओं की दूसरी गति के अनुसार 3 तख्ते पर । इस माइक्रोस्कोप के बाद से व्यावसायिक रूप से उपलब्ध है, इस पांडुलिपि का लक्ष्य विवरण में वर्णन और छवि अधिग्रहण, पंजीकरण के लिए खुला स्रोत उपकरण और प्रोटोकॉल प्रदान करने के लिए है, और दृश्य एसडी TIRF माइक्रोस्कोपी के साथ जुड़े.
सेटअप स्वतंत्र बंदरगाहों के माध्यम से दो स्कैन इकाइयों से जुड़े एक औंधा माइक्रोस्कोप पर आधारित है-बाएँ बंदरगाह एसडी यूनिट और TIRF और फोटो-सक्रियण/ब्लीचिंग प्रयोगों के लिए स्कैनर इकाई के लिए वापस बंदरगाह से जुड़ा हुआ है. अप करने के लिए 6 पराबैंगनीकिरण (405/445/488/515/561/640 एनएम) उत्तेजना के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । उत्तेजना और प्रतिदीप्ति संकेत का पता लगाने के लिए, या तो एक 100x/ना 1.45 तेल या 60x/ना 1.49 तेल TIRF उद्देश्य, क्रमशः, कार्यरत किया गया है । उत्सर्जित प्रकाश एक dichroic मिरर द्वारा विभाजित है (५६१ एनएम लंबे समय से गुजारें या ५१४ एनएम लंबे समय से गुजारें) और विभिंन बैंड से गुजारें फिल्टर द्वारा फ़िल्टर (५५ एनएम व्यापक ५२५ एनएम पर केंद्रित है, ५४ एनएम वाइड हरे और लाल प्रतिदीप्ति के लिए ६०९ एनएम पर केंद्रित, क्रमशः) दो EM-सीसीडी कैम के सामने रखा युग. कृपया ध्यान दें कि सेटअप के बारे में अधिक तकनीकी जानकारी Zobiak एट अल में सूचीबद्ध हैं । 7. TIRF विंयास में, एसडी इकाई के लगभग ०.५ एस के भीतर प्रकाश पथ से बाहर चला गया है ताकि एक ही दो कैमरों का पता लगाने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, तेजी से दो इमेजिंग विधियों के बीच लगभग 1 s है कि पिछले 13 में बताया गया था की तुलना में स्विचन की अनुमति. इस सुविधा दोहरे चैनल एक साथ अधिग्रहण, इस प्रकार 4 चैनल एसडी-TIRF इमेजिंग पहले बेजोड़ गति और सटीकता पर प्रदर्शन किया जा सकता है सक्षम बनाता है । इसके अलावा, एसडी और TIRF छवियों के बीच संरेखण अनावश्यक है । दो कैमरों के बीच छवि संरेखण, तथापि, के लिए प्रयोग शुरू करने से पहले की जांच की है और यदि आवश्यक सही । निम्न प्रोटोकॉल में एक पंजीकरण सुधार रूटिन एक स्व-लिखे ImageJ मैक्रो में लागू किया गया था । इसके अलावा, मैक्रो मुख्य रूप से अपने अलग आयामीता के बावजूद एसडी और TIRF डेटासेट के एक साथ दृश्य की अनुमति देने के लिए बनाया गया था । अधिग्रहण सॉफ्टवेयर खुद इन सुविधाओं प्रदान नहीं किया ।
Protocol
Representative Results
Discussion
इस पत्र में एसडी और TIRF माइक्रोस्कोपी का पहला सफल कार्यान्वयन लाइव सेल इमेजिंग प्रयोगों के प्रदर्शन के लिए उपयुक्त एक विन्यास में प्रस्तुत किया गया था, जैसे कि 2 एसडी-TIRF छवि के रूप में उच्च अधिग्रहण दर…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
हम बहुत विश्वविद्यालय चिकित्सा केंद्र हैंबर्ग के वैज्ञानिक समुदाय धंयवाद हमें मूल्यांकन के लिए नमूनों के साथ समर्थन के लिए Eppendorf । अर्थात्, हम NIH3T3 कोशिकाओं के लिए सबीन Windhorst, Andrea Mordhorst के लिए YFP-Vinculin और मरेन रूडोल्फ आरएफपी-Lifeact के लिए धंयवाद ।
Materials
| Microscope and accessories | |||
| SD-TIRF microscope | Visitron Systems | ||
| Ti with perfect focus system | Nikon | Inverted microscope stand | |
| CSU-W1 T2 | Yokogawa | Spinning disk unit in dual-camera configuration | |
| iLAS2 | Roper Scientific | TIRF/FRAP scanner | |
| Evolve | Photometrix | EM-CCD cameras | |
| PiezoZ stage | Ludl Electronic Products | Motorized Z stage | |
| Bioprecision2 XY stage | Ludl Electronic Products | Motorized XY stage | |
| Stage top incubation chamber | Okolab | Bold Line | Temperature, CO2 and humidity supply |
| Cell culture | |||
| HeLa cervical cancer cells | DSMZ | ACC-57 | |
| NIH3T3 fibroblasts | DSMZ | ACC-59 | |
| Dulbecco's phosphate buffered saline (PBS) | Gibco | 14190144 | |
| Trypsin-EDTA 0.05% | Gibco | 25300054 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium + GlutaMAX-I (DMEM) | Gibco | 31966-021 | |
| OptiMEM | Gibco | 31985070 | Reduced serum medium |
| Fetal calf serum (FCS) | Gibco | 10500064 | |
| Penicillin/Streptomycin (PenStrep) | Gibco | 15140148 | |
| Full growth medium (DMEM supplemented with 10% FCS and 1% PenStrep) | |||
| TurboFect | ThermoFisher Scientific | R0531 | Transfection reagent |
| Ascorbic acid (AA) | Sigma | A544-25G | |
| 6-well cell culture plate | Sarstedt | 83.392 | |
| Glass bottom dishes | MatTek | P35G-1.5-10-C | 35mm, 0.17mm glass coverslip |
| Fibronectin, bovine plasma | ThermoFisher Scientific | 33010018 | |
| Neubauer improved chamber | VWR | 631-0696 | |
| TetraSpeck beads | ThermoFisher Scientific | T7279 | |
| Plasmids | |||
| RFP-Lifeact | Maren Rudolph, Institute of Medical Microbiology, University Medical Center Hamburg Eppendorf, Germany | ||
| YFP-Vinculin | Andrea Mordhorst, Institute of Medical Microbiology, University Medical Center Hamburg Eppendorf, Germany | ||
| Software and plugins | |||
| VisiView | Visitron Systems | Version 3 | |
| ImageJ | Version 1.52c | ||
| Turboreg plugin | http://bigwww.epfl.ch/thevenaz/turboreg/ | ||
| Macro "SD-TIRF_helper_JoVE.ijm" | this publication | https://github.com/bzobiak/ImageJ | |
| Volocity | PerkinElmer | Version 6.2.2 |
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