Visualisierung von Adhäsion Bildung in den Zellen durch erweiterte Spinning-Disk-Total Internal Reflection-Fluoreszenz-Mikroskopie
Summary
Eine erweiterte Mikroskop, die es ermöglichen schnelle und hochauflösende werden Bildgebung des isolierten Plasmamembran sowohl die umliegenden intrazelluläre Volumen präsentiert. Die Integration von spinning-Disk und Gesamtbetrag interne Reflexion Fluoreszenzmikroskopie in einer Aufspannung ermöglicht live-imaging-Experimente bei hohen Erfassungsraten bis zu 3,5 s pro Bildstapel.
Abstract
In lebenden Zellen beinhalten Prozesse wie Adhäsion Bildung umfangreiche strukturelle Veränderungen in der Plasmamembran und das Zellinnere. Um diese hoch dynamischen Events sichtbar zu machen, wurden zwei komplementäre lichtmikroskopische Techniken, mit denen schnelle Bildgebung live Proben kombiniert: spinning Disk Mikroskopie (SD) für schnelle und hochauflösende Volumen Aufnahme und Totalreflexion Fluoreszenzmikroskopie (TIRF) für die präzise Lokalisierung und Visualisierung der Plasmamembran. Eine umfassende und vollständige imaging-Protokoll wird für Führung durch Probenvorbereitung, Mikroskop Kalibrierung, Imagebildung und Erwerb, wodurch Multi-Color SD-TIRF live imaging Serie mit hoher räumlich-zeitliche Auflösung angezeigt. Alle gewünschten Bild Nachbearbeitung Schritte, Multi-dimensionale live imaging Datasets, d.h. Anmeldung und Kombination der einzelnen Kanäle zu generieren sind ein selbst geschriebenes Makro für die open-Source-Software ImageJ zur Verfügung gestellt. Die Darstellung der fluoreszierenden Proteinen während der Initiation und Reifung der Adhäsion-komplexe sowie die Bildung des Aktin-Zytoskeletts Netzwerks, diente als Beweis der Grundsatz dieser neuartige Ansatz. Die Kombination aus hochauflösenden 3D Mikroskopie und TIRF zur Verfügung gestellt, einer detaillierten Beschreibung dieser komplexen Prozesse innerhalb der zellulären Umgebung und gleichzeitig präzise Lokalisierung der membranassoziierten Moleküle erkannt mit hohem Signal-Hintergrund-Verhältnis.
Introduction
Unsere Tage entwickeln sich rasch lichtmikroskopische Techniken bietet High/Super Resolution Imaging in festen und lebenden Exemplar. Höchstauflösung Techniken wie z. B. stimulierte Emission Depletion (STED), strukturierte Beleuchtung Mikroskopie (SIM) und Foto-Aktivierung Lokalisierung Mikroskopie (PALM) oder direkte stochastische optische Rekonstruktion Mikroskopie (Sturm), bzw. sind im Handel erhältlich und ermöglichen die Darstellung der subzellulären Strukturen zeigt Details fast auf molekularer Ebene1,2,3,4,5,6. Allerdings haben diese Ansätze noch Anwendbarkeit für live-imaging-Experimente beschränkt, in denen große Mengen mit mehreren Frames pro Sekunde Erwerb visualisiert werden müssen. Sorten von hochdynamischen Prozessen über die Plasmamembran, z.B. Endo – reguliert / Exozytose, Adhäsion, Migration oder Signalisierung, mit hoher Geschwindigkeit in zellulären Großmengen auftreten. Um diese Lücke zu füllen, war eine integrierte Mikroskopie-Technik vor kurzem vorgeschlagenen genannt Spinning Disk-TIRF (SD-TIRF)7. Im einzelnen ermöglicht TIRF-Mikroskopie speziell isolieren und lokalisieren die Plasmamembran8,9, während SD Mikroskopie eine der sensibelsten und schnellen ist Leben bildgebende Verfahren zur Visualisierung und Verfolgung von subzellularen Organellen im Zytoplasma10,11. Die Kombination der beiden bildgebenden Verfahren in einer einzigen Aufspannung hat bereits in den vergangenen12,13realisiert, jedoch das Mikroskop (Abbildung 1) vorgestellte endlich erfüllt die Kriterien um live imaging SD-TIRF-Experimente durchzuführen die oben genannten Prozesse mit 3 Bildern pro Sekunde. Da dieses Mikroskop im Handel erhältlich ist, ist das Ziel dieser Handschrift zu ausführlich beschreiben und open Source Tools und Protokolle für Bildaufnahme, Registrierung und Visualisierung mit SD-TIRF-Mikroskopie verbunden.
Das Setup basiert auf einem inversen Mikroskop mit zwei Scan-Einheiten über unabhängige Ports verbunden – der linken Anschluss ist verbunden mit der SD-Einheit und den hinteren Port Scanner-Einheit für TIRF und Foto-Aktivierung /-bleichen Experimente. Bis zu 6 Laser (405/445/488/515/561/640 nm) kann zur Anregung verwendet werden. Für die Anregung und Detektion der Fluoreszenzsignal, entweder 100 X / NA1.45 Öl oder 60 X / NA1.49 Öl TIRF Ziel bzw. beschäftigt waren. Das ausgestrahlte Licht durch einen dichroitischen Spiegel (561 nm lang-Pass oder 514 nm lang-Pass) aufgeteilt und durch verschiedene Bandpass-Filter gefiltert (55 nm Breite zentriert auf 525 nm, 54 nm Breite zentriert auf 609 nm für grüne und rote Fluoreszenz, beziehungsweise) vor die beiden EM-CCD-Kamera platziert Epochen. Bitte beachten Sie, dass weitere technische Details über das Setup in Zobiak Et Al. aufgeführt sind 7. in TIRF Konfiguration, bewegt sich die SD-Einheit aus dem Strahlengang innerhalb von ca. 0,5 s, dass die gleichen zwei Kameras für die Erkennung verwendet werden können, so dass schneller Wechsel zwischen den beiden bildgebenden Verfahren im Vergleich zu ca. 1 s, die in der Vergangenheit berichtet wurde13 . Diese Funktion ermöglicht die simultane Erfassung Zweikanal-, 4 Kanäle SD-TIRF imaging bei bisher unerreichte Geschwindigkeit und Genauigkeit durchgeführt werden kann. Darüber hinaus ist Ausrichtung zwischen SD und TIRF Bilder nicht erforderlich. Bildausrichtung zwischen den beiden Kameras muss jedoch vor Beginn des Experiments überprüft und gegebenenfalls korrigiert werden. In das folgende Protokoll wurde eine Registrierung-Korrektur-Routine in einem selbstgeschriebenen ImageJ-Makro umgesetzt. Darüber hinaus wurde das Makro hauptsächlich entwickelt, um eine gleichzeitige Visualisierung von SD und TIRF Datasets trotz ihrer unterschiedlichen Dimensionalität zu ermöglichen. Die Datenerfassungs-Software selbst bieten nicht diese Funktionen.
Protocol
Representative Results
Discussion
In diesem Papier wurde die erste erfolgreiche Implementierung von SD und TIRF-Mikroskopie in einer Konfiguration für experimentieren live Cell imaging, d.h. hohe Erfassungsraten wie 2 SD-TIRF Bild Stapel pro Minute bei 3 verschiedenen Bühne vorgestellt. Positionen, entsprechend insgesamt 168 Rahmen (ca. 3 Bilder pro Sekunde), erworben wurden. Die paar SD-TIRF-Mikroskope, die zuvor beschriebenen12,13, vor allem fehlende ausreichend Highspeed imaging, ze…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wir danken sehr die wissenschaftliche Gemeinschaft von des Universitätsklinikums Hamburg-Eppendorf unterstützt uns mit Proben zur Auswertung. Nämlich, wir danken Sabine Windhorst für NIH3T3 Zellen, Andrea Mordhorst für YFP-Vinkulin und Maren Rudolph für RFP-Lifeact.
Materials
| Microscope and accessories | |||
| SD-TIRF microscope | Visitron Systems | ||
| Ti with perfect focus system | Nikon | Inverted microscope stand | |
| CSU-W1 T2 | Yokogawa | Spinning disk unit in dual-camera configuration | |
| iLAS2 | Roper Scientific | TIRF/FRAP scanner | |
| Evolve | Photometrix | EM-CCD cameras | |
| PiezoZ stage | Ludl Electronic Products | Motorized Z stage | |
| Bioprecision2 XY stage | Ludl Electronic Products | Motorized XY stage | |
| Stage top incubation chamber | Okolab | Bold Line | Temperature, CO2 and humidity supply |
| Cell culture | |||
| HeLa cervical cancer cells | DSMZ | ACC-57 | |
| NIH3T3 fibroblasts | DSMZ | ACC-59 | |
| Dulbecco's phosphate buffered saline (PBS) | Gibco | 14190144 | |
| Trypsin-EDTA 0.05% | Gibco | 25300054 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium + GlutaMAX-I (DMEM) | Gibco | 31966-021 | |
| OptiMEM | Gibco | 31985070 | Reduced serum medium |
| Fetal calf serum (FCS) | Gibco | 10500064 | |
| Penicillin/Streptomycin (PenStrep) | Gibco | 15140148 | |
| Full growth medium (DMEM supplemented with 10% FCS and 1% PenStrep) | |||
| TurboFect | ThermoFisher Scientific | R0531 | Transfection reagent |
| Ascorbic acid (AA) | Sigma | A544-25G | |
| 6-well cell culture plate | Sarstedt | 83.392 | |
| Glass bottom dishes | MatTek | P35G-1.5-10-C | 35mm, 0.17mm glass coverslip |
| Fibronectin, bovine plasma | ThermoFisher Scientific | 33010018 | |
| Neubauer improved chamber | VWR | 631-0696 | |
| TetraSpeck beads | ThermoFisher Scientific | T7279 | |
| Plasmids | |||
| RFP-Lifeact | Maren Rudolph, Institute of Medical Microbiology, University Medical Center Hamburg Eppendorf, Germany | ||
| YFP-Vinculin | Andrea Mordhorst, Institute of Medical Microbiology, University Medical Center Hamburg Eppendorf, Germany | ||
| Software and plugins | |||
| VisiView | Visitron Systems | Version 3 | |
| ImageJ | Version 1.52c | ||
| Turboreg plugin | http://bigwww.epfl.ch/thevenaz/turboreg/ | ||
| Macro "SD-TIRF_helper_JoVE.ijm" | this publication | https://github.com/bzobiak/ImageJ | |
| Volocity | PerkinElmer | Version 6.2.2 |
Riferimenti
- Hell, S. W., Wichmann, J. Breaking the diffraction resolution limit by stimulated emission: stimulated-emission-depletion fluorescence microscopy. Optics Letters. 19 (11), 780 (1994).
- Gustafsson, M. G. L. Surpassing the lateral resolution limit by a factor of two using structured illumination microscopy. Journal of Microscopy. 198 (2), 82-87 (2000).
- Betzig, E., et al. Imaging intracellular fluorescent proteins at nanometer resolution. Science. 313 (5793), 1642-1645 (2006).
- Hess, S. T., Girirajan, T. P. K., Mason, M. D. Ultra-high resolution imaging by fluorescence photoactivation localization microscopy. Biophysical Journal. 91 (11), 4258-4272 (2006).
- Rust, M. J., Bates, M., Zhuang, X. Sub-diffraction-limit imaging by stochastic optical reconstruction microscopy (STORM). Nature methods. 3 (10), 793-796 (2006).
- van de Linde, S., et al. Direct stochastic optical reconstruction microscopy with standard fluorescent probes. Nature protocols. 6 (7), 991-1009 (2011).
- Zobiak, B., Failla, A. V. Advanced spinning disk-TIRF microscopy for faster imaging of the cell interior and the plasma membrane. Journal of Microscopy. 269 (3), 282-290 (2018).
- Mattheyses, A. L., Simon, S. M., Rappoport, J. Z. Imaging with total internal reflection fluorescence microscopy for the cell biologist. Journal of Cell Science. 123 (21), 3621-3628 (2010).
- Burchfield, J. G., Lopez, J. A., Vallotton, P., William, E. Exocytotic vesicle behaviour assessed by total internal reflection fluorescence microscopy. Traffic. 11 (4), 429-439 (2010).
- Oreopoulos, J., Berman, R., Browne, M. Spinning-disk confocal microscopy. present technology and future trends. Methods in Cell Biology. 123, 153-175 (2014).
- Murray, J. M., Appleton, P. L., Swedlow, J. R., Waters, J. C. Evaluating performance in three-dimensional fluorescence microscopy. Journal of Microscopy. 228 (3), 390-405 (2007).
- Trache, A., Lim, S. -. M. Integrated microscopy for real-time imaging of mechanotransduction studies in live cells. Journal of Biomedical Optics. 14 (3), 034024 (2009).
- Stehbens, S., Pemble, H., Murrow, L., Wittmann, T. Imaging intracellular protein dynamics by spinning disk confocal microscopy. Methods in Enzymology. , 293-313 (2012).
- Waldchen, S., Lehmann, J., Klein, T., Van De Linde, S., Sauer, M. Light-induced cell damage in live-cell super-resolution microscopy. Scientific Reports. 5, 1-12 (2015).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Thévenaz, P., Ruttimann, U. E., Unser, M. A pyramid approach to subpixel registration based on intensity. IEEE Transactions on Image Processing. 7 (1), 27-41 (1998).
- Partridge, M. A. Initiation of attachment and generation of mature focal adhesions by integrin-containing filopodia in cell spreading. Molecular Biology of the Cell. 17 (10), (2006).
- Dubin-Thaler, B. J., Giannone, G., Döbereiner, H. G., Sheetz, M. P. Nanometer analysis of cell spreading on matrix-coated surfaces reveals two distinct cell states and STEPs. Biophysical Journal. 86 (3), 1794-1806 (2004).
- Choi, C. K., Vicente-Manzanares, M., Zareno, J., Whitmore, L. A., Mogilner, A., Horwitz, A. R. Actin and α-actinin orchestrate the assembly and maturation of nascent adhesions in a myosin II motor-independent manner. Nature Cell Biology. 10 (9), 1039-1050 (2008).
- Bachir, A. I., Zareno, J., Moissoglu, K., Plow, E. F., Gratton, E., Horwitz, A. R. Integrin-associated complexes form hierarchically with variable stoichiometry in nascent adhesions. Current Biology. 24 (16), 1845-1853 (2014).
- Sun, Z., Guo, S. S., Fässler, R. Integrin-mediated mechanotransduction. Journal of Cell Biology. 215 (4), 445-456 (2016).
- Shao, L., Kner, P., Rego, E. H., Gustafsson, M. G. L. Super-resolution 3D microscopy of live whole cells using structured illumination. Nat. Methods. 8 (12), 1044-1046 (2011).
- Chen, B. -. C., et al. Lattice light-sheet microscopy: Imaging molecules to embryos at high spatiotemporal resolution. Science. 346 (6208), 1257998-1257998 (2014).
- Fu, Y., Winter, P. W., Rojas, R., Wang, V., McAuliffe, M., Patterson, G. H. Axial superresolution via multiangle TIRF microscopy with sequential imaging and photobleaching. Proceedings of the National Academy of Sciences. 113 (16), 4368-4373 (2016).
- Boulanger, J., et al. Fast high-resolution 3D total internal reflection fluorescence microscopy by incidence angle scanning and azimuthal averaging. Proceedings of the National Academy of Sciences. 111 (48), 17164-17169 (2014).
