Visualizando a formação de adesão em células por meio de avançados girando a reflexão interna Total disco microscopia de fluorescência
Summary
Um microscópio avançado que permitem rápida e de alta resolução de imagem de ambos, a membrana plasmática isolada e o volume intracelular circundante, será apresentado. A integração de giro do disco e total microscopia de fluorescência de reflexão interna em uma configuração permite experiências de imagens ao vivo em taxas de aquisição elevado até 3.5 s por pilha de imagem.
Abstract
Em células vivas, processos tais como a formação de aderência envolvem grandes mudanças estruturais na membrana plasmática e o interior da célula. Para visualizar estes eventos altamente dinâmicos, duas técnicas de microscopia de luz complementares que permitem rápida imagem latente de amostras ao vivo foram combinadas: girando microscopia de disco (SD) para a gravação do volume rápido e de alta resolução e reflexão interna total microscopia de fluorescência (TIRF) para visualização da membrana plasmática e localização exacta. Um protocolo de imagem abrangente e completo será mostrado para guiar a aquisição, calibração de microscópio, formação de imagem e preparação da amostra, resultando em uma série de imagens ao vivo de cor multi SD-TIRF com alta resolução espaço-temporal. Todas as etapas de pós-processamento de imagem necessária para gerar multidimensional datasets de imagens ao vivo, ou seja, o registro e a combinação dos canais individuais, são fornecidas em uma macro auto escrita para o open source software ImageJ. A imagem latente de proteínas fluorescentes durante a iniciação e a maturação dos complexos de adesão, bem como a formação da rede do citoesqueleto de actina, foi utilizado como prova de princípio para esta nova abordagem. A combinação de microscopia 3D de alta resolução e TIRF forneceu uma descrição detalhada destes processos complexos dentro do ambiente celular e, ao mesmo tempo, localização exacta das moléculas da membrana-associado detectado com um alto relação de sinal-para-plano de fundo.
Introduction
Nossos dias, técnicas de microscopia de luz, fornecendo imagens de resolução alta/super no fixo e espécime vivo estão se desenvolvendo rapidamente. Técnicas de super-resolução como estimularam emissão depleção (STED), estruturada iluminação microscopia (SIM) e microscopia de localização de foto-ativação (PALM) ou microscopia direta reconstrução óptica estocástico (Tempestade), respectivamente, são comercialmente disponíveis e permitir a geração de imagens de estruturas subcelulares, mostrando detalhes quase na escala molecular1,2,3,4,5,6. No entanto, essas abordagens ainda limitados aplicabilidade para experiências de imagens ao vivo, em que grandes volumes precisam ser visualizado com múltiplos frames por segunda velocidade de aquisição. Variedades de processos altamente dinâmicos, regulamentados através da membrana plasmática, por exemplo, endo- / exocitose, adesão, migração ou sinalização, ocorrem com alta velocidade dentro de grandes volumes de celulares. Recentemente, a fim de preencher esta lacuna, uma técnica de microscopia integrado foi proposto girando chamado disco-TIRF (SD-TIRF)7. No detalhe, microscopia TIRF permite especificamente isolar e localizar a membrana plasmática8,9, enquanto SD microscopia é um dos mais sensíveis e rápido viver técnicas de imagem para a visualização e acompanhamento das organelas subcelulares na citoplasma10,11. A combinação de ambas as técnicas de imagem em uma única instalação já foi realizada no últimos12,13, no entanto, o microscópio aqui apresentado (Figura 1) finalmente cumpre os critérios para realizar experimentos de SD-TIRF de imagens ao vivo os processos acima mencionados em 3 frames por segunda velocidade. Desde que este microscópio é comercialmente disponível, o objetivo deste manuscrito é descrever em detalhes e fornecer ferramentas open source e protocolos para aquisição de imagens, registro e visualização associada a microscopia SD-TIRF.
A instalação é baseada em um microscópio invertido ligado a varredura duas unidades através de portas independentes – porta esquerda está ligada à unidade SD e porta traseira para a unidade do scanner para TIRF e foto-ativação/branqueamento experimentos. Lasers de até 6 (405/445/488/515/561/640 nm) pode ser usado para a excitação. Excitação e detecção do sinal de fluorescência, ou um 100 x / óleo NA1.45 ou 60 x / óleo NA1.49 objetivo TIRF, respectivamente, têm sido empregadas. A luz emitida é dividida por um espelho dicroico (561 nm-passe longo ou 514 nm long-pass) e filtrado por vários filtros passa-banda (55 nm de largura centrada em 525 nm, 54 nm de largura centrada em 609 nm para fluorescência verde e vermelha, respectivamente) colocado na frente da cam CCD EM dois épocas. Por favor, note que os detalhes mais técnicos sobre a instalação estão listados na Zobiak et al 7. na configuração TIRF, a unidade de SD é movido para fora o trajeto da luz dentro de cerca de 0,5 s para que as mesmas duas câmeras podem ser usadas para a deteção, permitindo a comutação rápida entre as duas modalidades de imagem em comparação com cerca de 1 s, o que foi relatado no passado13 . Este recurso permite a aquisição simultânea de canal duplo, assim, 4 canais SD-TIRF imagem no anteriormente velocidade incomparável e precisão pode ser executada. Além disso, o alinhamento entre imagens SD e TIRF é desnecessário. Alinhamento de imagem entre as duas câmaras, no entanto, deve ser verificada antes de iniciar o experimento e corrigidos, se necessário. No seguinte protocolo, uma rotina de correção de registro foi implementada em uma macro auto escrita do ImageJ. Além disso, a macro foi principalmente projetada para permitir uma visualização simultânea do SD – e datasets TIRF apesar de sua dimensionalidade diferente. O software de aquisição não fornecer esses recursos.
Protocol
Representative Results
Discussion
Neste trabalho foi apresentado a primeira implementação bem sucedida da microscopia SD e TIRF em uma configuração adequada para a realização de experiências imagem de célula viva, ou seja, taxas de aquisição elevado, tais como 2 pilhas de imagem SD-TIRF por minuto 3 fase diferente posições, correspondentes a um total de 168 quadros (cerca de 3 quadros por segundo), foram adquiridas. Os microscópios de SD-TIRF alguns que eram anteriormente descrito12,<sup class="xre…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecemos muito a comunidade científica da Universidade Medical Center Hamburg-Eppendorf nos apoiar com amostras para avaliação. Ou seja, agradecemos-Sabine Windhorst NIH3T3 células, Andrea Mordhorst para YFP-vinculina e Maren Rudolph para RFP-Lifeact.
Materials
| Microscope and accessories | |||
| SD-TIRF microscope | Visitron Systems | ||
| Ti with perfect focus system | Nikon | Inverted microscope stand | |
| CSU-W1 T2 | Yokogawa | Spinning disk unit in dual-camera configuration | |
| iLAS2 | Roper Scientific | TIRF/FRAP scanner | |
| Evolve | Photometrix | EM-CCD cameras | |
| PiezoZ stage | Ludl Electronic Products | Motorized Z stage | |
| Bioprecision2 XY stage | Ludl Electronic Products | Motorized XY stage | |
| Stage top incubation chamber | Okolab | Bold Line | Temperature, CO2 and humidity supply |
| Cell culture | |||
| HeLa cervical cancer cells | DSMZ | ACC-57 | |
| NIH3T3 fibroblasts | DSMZ | ACC-59 | |
| Dulbecco's phosphate buffered saline (PBS) | Gibco | 14190144 | |
| Trypsin-EDTA 0.05% | Gibco | 25300054 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium + GlutaMAX-I (DMEM) | Gibco | 31966-021 | |
| OptiMEM | Gibco | 31985070 | Reduced serum medium |
| Fetal calf serum (FCS) | Gibco | 10500064 | |
| Penicillin/Streptomycin (PenStrep) | Gibco | 15140148 | |
| Full growth medium (DMEM supplemented with 10% FCS and 1% PenStrep) | |||
| TurboFect | ThermoFisher Scientific | R0531 | Transfection reagent |
| Ascorbic acid (AA) | Sigma | A544-25G | |
| 6-well cell culture plate | Sarstedt | 83.392 | |
| Glass bottom dishes | MatTek | P35G-1.5-10-C | 35mm, 0.17mm glass coverslip |
| Fibronectin, bovine plasma | ThermoFisher Scientific | 33010018 | |
| Neubauer improved chamber | VWR | 631-0696 | |
| TetraSpeck beads | ThermoFisher Scientific | T7279 | |
| Plasmids | |||
| RFP-Lifeact | Maren Rudolph, Institute of Medical Microbiology, University Medical Center Hamburg Eppendorf, Germany | ||
| YFP-Vinculin | Andrea Mordhorst, Institute of Medical Microbiology, University Medical Center Hamburg Eppendorf, Germany | ||
| Software and plugins | |||
| VisiView | Visitron Systems | Version 3 | |
| ImageJ | Version 1.52c | ||
| Turboreg plugin | http://bigwww.epfl.ch/thevenaz/turboreg/ | ||
| Macro "SD-TIRF_helper_JoVE.ijm" | this publication | https://github.com/bzobiak/ImageJ | |
| Volocity | PerkinElmer | Version 6.2.2 |
Riferimenti
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