Visualizar la formación de adherencias en las células por medio de avanzados Spinning microscopía de fluorescencia de reflexión interna Total de disco
Summary
Un microscopio avanzado que permite rápido y de alta resolución de imagen de la membrana plasmática aislada y el volumen intracelular circundante, se presentará. La integración de microscopía de fluorescencia de reflexión interna disco y total en una configuración de giro permite energizados experimentos de imagen a precios de adquisición alto hasta 3.5 s por grupo imagen.
Abstract
En las células vivas, procesos como la formación de adherencias implican grandes cambios estructurales en la membrana plasmática y el interior de la célula. Para poder visualizar estos eventos altamente dinámicos, se combinaron dos técnicas de microscopía de luz complementarias que permiten la proyección de imagen rápida de muestras vivo: girar a microscopía de disco (SD) para el registro del volumen rápido y de alta resolución y reflexión interna total Microscopía de fluorescencia (TIRF) para localización precisa y la visualización de la membrana plasmática. Aparecerá un protocolo de imagen integral y completado para guiar a través de la preparación de la muestra, calibración de microscopios, formación de la imagen y adquisición, dando por resultado varios color SD-TIRF de serie con alta resolución espacio-temporal. Todos pasos post procesado de imagen necesario para generar multidimensional vivo de conjuntos de datos, es decir, registro y combinación de los canales individuales, se proporcionan en una macro por escrito para el software de código abierto ImageJ. La proyección de imagen de proteínas fluorescentes durante la iniciación y maduración de los complejos de adhesión, así como la formación de la red del citoesqueleto de actina, fue utilizado como una prueba del principio de este nuevo enfoque. La combinación de microscopia de alta resolución 3D y TIRF proporciona una descripción detallada de estos procesos complejos en el entorno celular y, al mismo tiempo, localización precisa de las moléculas asociadas a membrana detectada con una alta relación de señal a fondo.
Introduction
Nuestros días, técnicas de microscopía de luz proporciona la proyección de imagen estupendo de alta resolución en fijo y vida ejemplar están desarrollando rápidamente. Técnicas de súper-resolución como estimularon emisión microscopía de iluminación de agotamiento (STED), estructurado (SIM) y microscopía de localización de foto activación (PALM) o microscopía directa reconstrucción óptica estocástica (tormenta), respectivamente, son disponible en el mercado y permiten la proyección de imagen de estructuras subcelulares que muestra detalles casi en la escala molecular1,2,3,4,5,6. Sin embargo, estos enfoques todavía han limitado aplicabilidad para los experimentos de imagen vivo en que grandes volúmenes deben visualizarse con varios fotogramas por segundo la velocidad de adquisición. Variedades de procesos altamente dinámicos regulados a través de la membrana plasmática, por ejemplo, endo- / exocitosis, adherencia, migración o señalización, se producen con alta velocidad dentro de grandes volúmenes celulares. Recientemente, con el fin de llenar este vacío, una técnica de microscopía integrado fue propuesto llamado spinning disco-TIRF (SD-TIRF)7. En detalle, microscopía TIRF permite específicamente aislar y localizar la membrana del plasma8,9, mientras que la microscopia SD es uno de los más sensibles y rápidas en vivo las técnicas de imagen para la visualización y seguimiento de orgánulos subcelulares en el citoplasma10,11. La combinación de ambas técnicas de imagen en una sola configuración ya se ha realizado en los últimos12,13, sin embargo, el microscopio (Figura 1) presentan finalmente cumple con los criterios para realizar experimentos de SD-TIRF imagen vivo de dichos procesos a 3 fotogramas por segundo la velocidad. Puesto que este microscopio está comercialmente disponible, el objetivo de este manuscrito debe describir en detalle y proporcionar herramientas de código abierto y protocolos de adquisición de imágenes, registro y visualización asociadas con microscopía TIRF de SD.
La configuración se basa en un microscopio invertido conectado a unidades de exploración de dos vía puertos independientes – el puerto izquierdo está vinculado a la unidad de la SD y el puerto posterior a la unidad de escáner para TIRF y foto activación/blanqueamiento experimentos. Hasta 6 láseres (405/445/488/515/561/640 nm) puede ser utilizado para la excitación. De excitación y detección de la señal de fluorescencia, ya sea un 100 x / NA1.45 de aceite o 60 x / NA1.49 aceite objetivo TIRF, respectivamente, han sido empleados. La luz emitida es dividida por un espejo dicroico (561 nm largo-pase o 514 nm largo-) y filtrada por diversos filtros band-pass (55 nm amplia centrada en 525 nm, 54 nm amplia centrada en 609 nm para fluorescencia verde y roja, respectivamente) colocado delante de la cam EM-CCD dos eras. Tenga en cuenta que más técnica acerca de la configuración se detalla en Zobiak et al. 7. en la configuración de la TIRF, la unidad de la SD se mueve fuera de la trayectoria de la luz dentro de alrededor de 0.5 s para que el mismo dos cámaras pueden utilizarse para la detección, lo que permite una conmutación más rápida entre las dos modalidades de proyección de imagen en comparación con alrededor de 1 s que fue divulgado en el pasado13 . Esta característica permite la adquisición simultánea de dos canales, 4 canales SD-TIRF imágenes en previamente incomparable velocidad y precisión se puede realizar. Por otra parte, la alineación entre imágenes SD y TIRF es innecesaria. Alineación de la imagen entre las dos cámaras, sin embargo, tiene que ser revisado antes de iniciar el experimento y corregida si es necesario. En el siguiente protocolo, se implementó una rutina de corrección de registro en una macro ImageJ uno mismo-escrita. Por otra parte, la macro principalmente fue diseñada para permitir una visualización simultánea de conjuntos de datos TIRF a pesar de su diferente dimensionalidad y SD. El software de adquisición no presentó estas características.
Protocol
Representative Results
Discussion
En este trabajo se presentó la primera aplicación exitosa de la SD y TIRF microscopia en una configuración conveniente para llevar a cabo experimentos imágenes de células vivas, es decir, las tasas de adquisición alto como 2 pilas de imagen de SD-TIRF por minuto a 3 alturas diferentes posiciones, correspondientes a un total de 168 marcos (alrededor de 3 fotogramas por segundo), fueron adquiridas. Algunos microscopios TIRF SD que fueron describen12,13</su…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecemos enormemente a la comunidad científica de la Universidad médica Center Hamburg-Eppendorf para apoyarnos con las muestras para evaluación. Es decir, agradecemos Sabine Windhorst células NIH3T3, Andrea Mordhorst de YFP-vinculina y Maren Rudolph de RFP-Lifeact.
Materials
| Microscope and accessories | |||
| SD-TIRF microscope | Visitron Systems | ||
| Ti with perfect focus system | Nikon | Inverted microscope stand | |
| CSU-W1 T2 | Yokogawa | Spinning disk unit in dual-camera configuration | |
| iLAS2 | Roper Scientific | TIRF/FRAP scanner | |
| Evolve | Photometrix | EM-CCD cameras | |
| PiezoZ stage | Ludl Electronic Products | Motorized Z stage | |
| Bioprecision2 XY stage | Ludl Electronic Products | Motorized XY stage | |
| Stage top incubation chamber | Okolab | Bold Line | Temperature, CO2 and humidity supply |
| Cell culture | |||
| HeLa cervical cancer cells | DSMZ | ACC-57 | |
| NIH3T3 fibroblasts | DSMZ | ACC-59 | |
| Dulbecco's phosphate buffered saline (PBS) | Gibco | 14190144 | |
| Trypsin-EDTA 0.05% | Gibco | 25300054 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium + GlutaMAX-I (DMEM) | Gibco | 31966-021 | |
| OptiMEM | Gibco | 31985070 | Reduced serum medium |
| Fetal calf serum (FCS) | Gibco | 10500064 | |
| Penicillin/Streptomycin (PenStrep) | Gibco | 15140148 | |
| Full growth medium (DMEM supplemented with 10% FCS and 1% PenStrep) | |||
| TurboFect | ThermoFisher Scientific | R0531 | Transfection reagent |
| Ascorbic acid (AA) | Sigma | A544-25G | |
| 6-well cell culture plate | Sarstedt | 83.392 | |
| Glass bottom dishes | MatTek | P35G-1.5-10-C | 35mm, 0.17mm glass coverslip |
| Fibronectin, bovine plasma | ThermoFisher Scientific | 33010018 | |
| Neubauer improved chamber | VWR | 631-0696 | |
| TetraSpeck beads | ThermoFisher Scientific | T7279 | |
| Plasmids | |||
| RFP-Lifeact | Maren Rudolph, Institute of Medical Microbiology, University Medical Center Hamburg Eppendorf, Germany | ||
| YFP-Vinculin | Andrea Mordhorst, Institute of Medical Microbiology, University Medical Center Hamburg Eppendorf, Germany | ||
| Software and plugins | |||
| VisiView | Visitron Systems | Version 3 | |
| ImageJ | Version 1.52c | ||
| Turboreg plugin | http://bigwww.epfl.ch/thevenaz/turboreg/ | ||
| Macro "SD-TIRF_helper_JoVE.ijm" | this publication | https://github.com/bzobiak/ImageJ | |
| Volocity | PerkinElmer | Version 6.2.2 |
Riferimenti
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