Visualisera vidhäftning bildandet i celler med hjälp av avancerade Spinning Disk-totalt inre reflektion fluorescensmikroskopi
Summary
En avancerad Mikroskop som tillåter snabb och högupplöst kommer avbildning av både isolerade plasmamembranet och omgivande intracellulära volymen, att presenteras. Integrationen av spinning disk och total inre reflektion fluorescensmikroskopi i en setup tillåter levande imaging experiment på hög förvärv priser upp till 3,5 s per bildstapel.
Abstract
I levande celler innebär processer såsom vidhäftning bildning omfattande strukturella förändringar i plasmamembranet och cell inredningen. För att visualisera dessa högdynamiska händelser, två kompletterande ljusmikroskopi tekniker som tillåter snabb avbildning av levande prover kombinerades: spinning disk mikroskopi (SD) för snabb och högupplösta volym inspelning och Totalreflexion fluorescensmikroskopi (Frida) för exakt lokalisering och visualisering av plasmamembranet. En omfattande och komplett protokoll-avbildning visas för guidning provberedning, Mikroskop kalibrering, bild bildandet samt förvärv, vilket resulterar i flerfärgade SD-Frida levande imaging serien plats och tid med hög upplösning. Alla nödvändiga bild efterbehandling steg att generera flerdimensionella levande imaging datamängder, dvs registrering och kombination av de enskilda kanalerna, finns i en egenkomponerad makro för öppen källkod ImageJ. Bildtagning av fluorescerande proteiner under initiering och mognaden av vidhäftning komplex, liksom bildandet av aktin cytoskeletal nätverket, användes som ett bevis på principen för detta nya synsätt. Kombinationen av hög upplösning 3D mikroskopi och Frida som tillhandahålls en detaljerad beskrivning av dessa komplexa processer inom den cellulära miljön och, samtidigt, exakt lokalisering av membran-associerade molekyler upptäcks med en hög signal-till-bakgrund-förhållande.
Introduction
Våra dagar, ljusmikroskopi tekniker som ger hög/super resolution imaging i fasta och levande exemplar utvecklas snabbt. Super-upplösning tekniker såsom stimulerat utsläpp utarmning (STED), strukturerade belysningen mikroskopi (SIM) och foto-aktiveringen lokalisering mikroskopi (PALM) eller direkt stokastiska optiska återuppbyggnad mikroskopi (STORM), respektive, är kommersiellt tillgängliga och möjliggör avbildning av subcellulära strukturer visar detaljer nästan på molekylär skala1,2,3,4,5,6. Dock har dessa synsätt fortfarande begränsad tillämplighet för levande imaging experiment där stora volymer behöver visualiseras med flera bildrutor per andra förvärv hastighet. Sorter av mycket dynamiska processer regleras via plasmamembranet, e.g. endo- / exocytos, vidhäftning, migration eller signalering, förekomma med hög hastighet inom stora cellulära volymer. Nyligen, för att fylla upp detta tomrum, en integrerad mikroskopi teknik var föreslagna kallas spinning disk-Frida (SD-Frida)7. I detalj tillåter Frida mikroskopi att specifikt isolera och lokalisera den plasmamembran8,9, medan SD mikroskopi är en av de mest känsliga och snabba live imaging tekniker för visualisering och spårning av subcellulär organeller i cytoplasman10,11. Kombinationen av båda imaging tekniker i en enda installation har redan insett i senaste12,13, dock mikroskopet presenteras här (figur 1) Slutligen uppfyller kriterierna för att utföra live imaging SD-Frida experiment av de ovan nämnda processerna på 3 stommen per andra hastigheten. Eftersom detta Mikroskop är kommersiellt tillgängliga, är målet av detta manuskript att beskriva detaljer och tillhandahålla öppen källkod-verktyg och protokoll för bild förvärv, registrering och visualisering är associerad med SD-Frida mikroskopi.
Installationen bygger på ett inverterat Mikroskop ansluten till två Skanna enheter via oberoende portar – vänster porten är kopplad till enheten SD och den baksida porten att skannerenheten för Frida och foto-aktivering /-blekning experiment. Upp till 6 lasrar (405/445/488/515/561/640 nm) kan användas för magnetisering. För magnetisering och detektion av signalen fluorescens, antingen en 100 x / NA1.45 olja eller 60 x / NA1.49 olja Frida mål, respektive, har varit anställd. Det utsända ljuset är uppdelat på en dichroic spegel (561 nm lång-pass eller 514 nm lång-pass) och filtreras av olika band-passera filter (55 nm brett centrerad på 525 nm, 54 nm brett centrerad på 609 nm för grön och röd fluorescens, respektive) placeras framför två EM-CCD cam epoker. Observera att mer teknisk information om installationen finns i Zobiak et al. 7. i Frida konfiguration, SD enheten flyttas ut ur ljusstrålen inom cirka 0,5 s så att samma två kamerorna kan användas för detektion, tillåter snabbare växling mellan de två avbildningsmetoder jämfört med circa 1 s som rapporterades tidigare13 . Denna funktion möjliggör dubbla kanaler samtidiga förvärv, således 4 kanaler SD-Frida imaging på tidigare oöverträffad hastighet och noggrannhet kan utföras. Anpassningen mellan SD och Frida bilder är dessutom onödiga. Bildjustering mellan de två kamerorna, har dock skall kontrolleras innan du börjar experimentet och korrigeras om det behövs. I följande protokoll genomfördes en registrering korrigering rutin i en egenkomponerad ImageJ makro. Makrot var dessutom främst avsedd att möjliggöra en samtidig visualisering av SD- och Frida datamängder trots deras olika dimensionalitet. Själva förvärvet programvaran inte ger dessa funktioner.
Protocol
Representative Results
Discussion
I detta paper presenterades de första framgångsrika genomförandet av SD och Frida mikroskopi i en konfiguration som är lämplig för att utföra levande cell imaging experiment, dvs hög förvärv priser såsom 2 SD-Frida bildstaplar per minut i 3 olika skede positioner, motsvarande sammanlagt 168 ramar (cirka 3 bilder per sekund), förvärvades. Mikroskopen i några SD-Frida som var tidigare beskrivits12,13, främst avsaknaden av tillräckligt hög …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi tackar kraftigt det vetenskapliga samfundet av de University Medical Center Hamburg-Eppendorf för att stödja oss med prover för utvärdering. Nämligen, vi tackar Sabine Windhorst för NIH3T3 celler, Andrea Mordhorst för YFP-Vinculin och Maren Rudolph för RFP-Lifeact.
Materials
| Microscope and accessories | |||
| SD-TIRF microscope | Visitron Systems | ||
| Ti with perfect focus system | Nikon | Inverted microscope stand | |
| CSU-W1 T2 | Yokogawa | Spinning disk unit in dual-camera configuration | |
| iLAS2 | Roper Scientific | TIRF/FRAP scanner | |
| Evolve | Photometrix | EM-CCD cameras | |
| PiezoZ stage | Ludl Electronic Products | Motorized Z stage | |
| Bioprecision2 XY stage | Ludl Electronic Products | Motorized XY stage | |
| Stage top incubation chamber | Okolab | Bold Line | Temperature, CO2 and humidity supply |
| Cell culture | |||
| HeLa cervical cancer cells | DSMZ | ACC-57 | |
| NIH3T3 fibroblasts | DSMZ | ACC-59 | |
| Dulbecco's phosphate buffered saline (PBS) | Gibco | 14190144 | |
| Trypsin-EDTA 0.05% | Gibco | 25300054 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium + GlutaMAX-I (DMEM) | Gibco | 31966-021 | |
| OptiMEM | Gibco | 31985070 | Reduced serum medium |
| Fetal calf serum (FCS) | Gibco | 10500064 | |
| Penicillin/Streptomycin (PenStrep) | Gibco | 15140148 | |
| Full growth medium (DMEM supplemented with 10% FCS and 1% PenStrep) | |||
| TurboFect | ThermoFisher Scientific | R0531 | Transfection reagent |
| Ascorbic acid (AA) | Sigma | A544-25G | |
| 6-well cell culture plate | Sarstedt | 83.392 | |
| Glass bottom dishes | MatTek | P35G-1.5-10-C | 35mm, 0.17mm glass coverslip |
| Fibronectin, bovine plasma | ThermoFisher Scientific | 33010018 | |
| Neubauer improved chamber | VWR | 631-0696 | |
| TetraSpeck beads | ThermoFisher Scientific | T7279 | |
| Plasmids | |||
| RFP-Lifeact | Maren Rudolph, Institute of Medical Microbiology, University Medical Center Hamburg Eppendorf, Germany | ||
| YFP-Vinculin | Andrea Mordhorst, Institute of Medical Microbiology, University Medical Center Hamburg Eppendorf, Germany | ||
| Software and plugins | |||
| VisiView | Visitron Systems | Version 3 | |
| ImageJ | Version 1.52c | ||
| Turboreg plugin | http://bigwww.epfl.ch/thevenaz/turboreg/ | ||
| Macro "SD-TIRF_helper_JoVE.ijm" | this publication | https://github.com/bzobiak/ImageJ | |
| Volocity | PerkinElmer | Version 6.2.2 |
References
- Hell, S. W., Wichmann, J. Breaking the diffraction resolution limit by stimulated emission: stimulated-emission-depletion fluorescence microscopy. Optics Letters. 19 (11), 780 (1994).
- Gustafsson, M. G. L. Surpassing the lateral resolution limit by a factor of two using structured illumination microscopy. Journal of Microscopy. 198 (2), 82-87 (2000).
- Betzig, E., et al. Imaging intracellular fluorescent proteins at nanometer resolution. Science. 313 (5793), 1642-1645 (2006).
- Hess, S. T., Girirajan, T. P. K., Mason, M. D. Ultra-high resolution imaging by fluorescence photoactivation localization microscopy. Biophysical Journal. 91 (11), 4258-4272 (2006).
- Rust, M. J., Bates, M., Zhuang, X. Sub-diffraction-limit imaging by stochastic optical reconstruction microscopy (STORM). Nature methods. 3 (10), 793-796 (2006).
- van de Linde, S., et al. Direct stochastic optical reconstruction microscopy with standard fluorescent probes. Nature protocols. 6 (7), 991-1009 (2011).
- Zobiak, B., Failla, A. V. Advanced spinning disk-TIRF microscopy for faster imaging of the cell interior and the plasma membrane. Journal of Microscopy. 269 (3), 282-290 (2018).
- Mattheyses, A. L., Simon, S. M., Rappoport, J. Z. Imaging with total internal reflection fluorescence microscopy for the cell biologist. Journal of Cell Science. 123 (21), 3621-3628 (2010).
- Burchfield, J. G., Lopez, J. A., Vallotton, P., William, E. Exocytotic vesicle behaviour assessed by total internal reflection fluorescence microscopy. Traffic. 11 (4), 429-439 (2010).
- Oreopoulos, J., Berman, R., Browne, M. Spinning-disk confocal microscopy. present technology and future trends. Methods in Cell Biology. 123, 153-175 (2014).
- Murray, J. M., Appleton, P. L., Swedlow, J. R., Waters, J. C. Evaluating performance in three-dimensional fluorescence microscopy. Journal of Microscopy. 228 (3), 390-405 (2007).
- Trache, A., Lim, S. -. M. Integrated microscopy for real-time imaging of mechanotransduction studies in live cells. Journal of Biomedical Optics. 14 (3), 034024 (2009).
- Stehbens, S., Pemble, H., Murrow, L., Wittmann, T. Imaging intracellular protein dynamics by spinning disk confocal microscopy. Methods in Enzymology. , 293-313 (2012).
- Waldchen, S., Lehmann, J., Klein, T., Van De Linde, S., Sauer, M. Light-induced cell damage in live-cell super-resolution microscopy. Scientific Reports. 5, 1-12 (2015).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Thévenaz, P., Ruttimann, U. E., Unser, M. A pyramid approach to subpixel registration based on intensity. IEEE Transactions on Image Processing. 7 (1), 27-41 (1998).
- Partridge, M. A. Initiation of attachment and generation of mature focal adhesions by integrin-containing filopodia in cell spreading. Molecular Biology of the Cell. 17 (10), (2006).
- Dubin-Thaler, B. J., Giannone, G., Döbereiner, H. G., Sheetz, M. P. Nanometer analysis of cell spreading on matrix-coated surfaces reveals two distinct cell states and STEPs. Biophysical Journal. 86 (3), 1794-1806 (2004).
- Choi, C. K., Vicente-Manzanares, M., Zareno, J., Whitmore, L. A., Mogilner, A., Horwitz, A. R. Actin and α-actinin orchestrate the assembly and maturation of nascent adhesions in a myosin II motor-independent manner. Nature Cell Biology. 10 (9), 1039-1050 (2008).
- Bachir, A. I., Zareno, J., Moissoglu, K., Plow, E. F., Gratton, E., Horwitz, A. R. Integrin-associated complexes form hierarchically with variable stoichiometry in nascent adhesions. Current Biology. 24 (16), 1845-1853 (2014).
- Sun, Z., Guo, S. S., Fässler, R. Integrin-mediated mechanotransduction. Journal of Cell Biology. 215 (4), 445-456 (2016).
- Shao, L., Kner, P., Rego, E. H., Gustafsson, M. G. L. Super-resolution 3D microscopy of live whole cells using structured illumination. Nat. Methods. 8 (12), 1044-1046 (2011).
- Chen, B. -. C., et al. Lattice light-sheet microscopy: Imaging molecules to embryos at high spatiotemporal resolution. Science. 346 (6208), 1257998-1257998 (2014).
- Fu, Y., Winter, P. W., Rojas, R., Wang, V., McAuliffe, M., Patterson, G. H. Axial superresolution via multiangle TIRF microscopy with sequential imaging and photobleaching. Proceedings of the National Academy of Sciences. 113 (16), 4368-4373 (2016).
- Boulanger, J., et al. Fast high-resolution 3D total internal reflection fluorescence microscopy by incidence angle scanning and azimuthal averaging. Proceedings of the National Academy of Sciences. 111 (48), 17164-17169 (2014).
