Hücreleri tarafından seçilmiş adezyon oluşumunda görselleştirme gelişmiş Disk-toplam iç yansıma floresans mikroskobu iplik
Summary
Hızlı ve yüksek çözünürlüklü izin gelişmiş bir mikroskop düşsel hem, izole plazma zarı ve çevredeki hücre içi hacim sunulacak. Yüksek edinme hesaplı en fazla 3,5 canlı görüntüleme deneyler bir kurulum disk ve toplam iç yansıma floresans mikroskobu iplik entegrasyon sağlar görüntü yığını başına s.
Abstract
Yaşam hücrelerinde adezyon oluşumunu gibi plazma zarı ve hücre iç kapsamlı yapısal değişiklikler gerektirir. Bu son derece dinamik olaylar görselleştirmek için canlı örnekleri hızlı görüntüleme sağlar iki tamamlayıcı ışık mikroskobu teknikleri kombine edilmiştir: hızlı ve yüksek çözünürlüklü ses kayıt ve toplam iç yansıma için disk mikroskobu (SD) iplik Floresan (TIRF) Mikroskopi için kesin yerelleştirme ve plazma zarı görselleştirme. Kapsamlı ve eksiksiz görüntüleme protokolü için numune hazırlama, mikroskop kalibrasyon, görüntü oluşumu ve satın alma rehberlik, çok renkli SD-TIRF canlı görüntüleme serisi yüksek spatio-zamansal çözünürlük ile sonuçlanan gösterilecek. Yani kayıt ve bireysel kanalları bileşimini, çok boyutlu canlı görüntüleme veri oluşturmak için tüm gerekli görüntü işleme adımları kendi yazılı bir makroda açık kaynak yazılımı ImageJ sağlanır. Başlatma sırasında floresan proteinlerin görüntüleme ve yapışma kompleksleri olgunlaşma yanı sıra aktin hücre iskeleti ağ oluşumu prensip bir kanıtı olarak bu yeni yaklaşımın için kullanıldı. Yüksek çözünürlükte 3D mikroskobu ve TIRF ile birlikte sağlanan bu karmaşık süreçler hücresel ortamı içinde ve aynı zamanda yüksek algılanan membran ilişkili moleküllerin kesin yerelleştirme ayrıntılı bir açıklaması sinyal arka plan oranı.
Introduction
Bizim gün içinde sabit yüksek/super kararlılık düşsel ve yaşam numune sağlayan ışık mikroskobu teknikleri hızla gelişiyor. Süper çözümleme teknikleri gibi uyarılmış emisyonu yapısal azalması (STED), ışık mikroskobu (SIM) ve fotoğraf-harekete geçirmek yerelleştirme mikroskobu (PALM) veya doğrudan Stokastik optik imar mikroskobu (fırtına), sırasıyla, vardır piyasada bulunan ve görüntüleme ayrıntıları neredeyse moleküler ölçek1,2,3,4,5,6‘ da gösterilen hücre altı yapıları etkinleştirin. Ancak, bu yaklaşımların hala geniş hacimli birden çok çerçevelemek-de ikinci Alım hızı ile görüntülenmeyecektir gereken canlı görüntüleme deneyler için uygulanabilirliği sınırlıdır. Plazma zarı ile Örneğin endo – düzenlenmiş Son derece dinamik süreçler çeşitleri / ekzositozu, adezyon, geçiş veya sinyal, ortaya büyük hücresel birimleri içinde yüksek hız ile. Son zamanlarda, bu boşluğu doldurmak için bir tümleşik mikroskobu tekniği önerilen denilen dönen disk-TIRF (SD-TIRF)7oldu. Özellikle yalıtmak ve plazma zarı8,9yerelleştirilmesine, iken SD mikroskobu en hassas ve hızlı görüntüleme teknikleri görselleştirme ve takibi için yaşamak için izin verir ayrıntılı olarak TIRF mikroskobu hücre altı organelleri sitoplazma10,11. Her iki görüntüleme teknikleri içinde a tek tertibat birleşimi zaten son12,13‘ te fark, ancak, burada sunulan (Şekil 1) mikroskop nihayet canlı görüntüleme SD-TIRF deneyleri gerçekleştirmek için ölçütleri karşılayan 3 çerçevelemek-de ikinci hız, söz konusu süreçleri. Bu mikroskop ticari olarak mevcut olduğundan, bu yazının amacı detaylı olarak tarif ve açık kaynak araçlar ve protokoller için resim alma, kayıt ve SD-TIRF mikroskobu ile ilişkili görselleştirme sağlar olduğunu.
Kurulum iki tarama birimlerine bağımsız bağlantı noktaları üzerinden bağlı bir ters mikroskobu dayanmaktadır – sol bağlantı noktası SD birim ve tarayıcı ünitesini geri bağlantı noktasına TIRF ve fotoğraf-harekete geçirmek /-beyazlatma için bağlı olduğu deneyler. 6 lazerler (405/445/488/515/561/640 nm) uyarma için kullanılabilir. Uyarma ve algılama floresans sinyalinin ya 100 x / NA1.45 yağ veya 60 x / NA1.49 petrol TIRF amaç, sırasıyla, istihdam. Verilmiş ışık bölünmüş bir Dikroik ayna tarafından (561 nm uzun-pass veya 514 nm uzun taramalı) ve çeşitli bant geçiren filtre tarafından filtre (55 nm geniş 525 merkezli nm, 54 609 merkezli nm geniş nm için yeşil ve kırmızı floresans, sırasıyla) iki EM-CCD cam önünde yer devirlerde. Lütfen kurulumu hakkında daha fazla teknik bilgi Zobiak vd. listelenen Not 7. TIRF yapılandırmada, SD birim içinde ışık yolu yaklaşık 0,5 dışına taşınır s böylece aynı iki fotoğraf makinesi-ebilmek var olmak kullanılmış için algılama, 1 karşılaştırıldığında iki görüntüleme yöntemleri arasında daha hızlı geçiş izin geçmişte bildirildi s13 . Bu özellik, Çift kanal aynı anda satın alma sağlar, böylece SD-TIRF, daha önce eşsiz hız Imaging 4 kanalları ve doğruluk gerçekleştirilebilir. Ayrıca, SD ve TIRF görüntüleri arasında uyum gereksizdir. Resim hizalaması iki kamera arasında ancak, deneme başlamadan önce kontrol edilmesi ve gerekirse düzeltilmiş var. Aşağıdaki protokolünde bir kayıt düzeltme rutin bir kendi kendini yazılı ImageJ makrosunda uygulanmıştır. Ayrıca, makro ağırlıklı olarak SD – ve onların farklı dimensionality rağmen TIRF veri kümeleri bir eş zamanlı görselleştirme izin vermek için tasarlanmıştır. Satın alma yazılım bu özellikler sağlamadı.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bu yazıda SD ve TIRF mikroskobu canlı hücre görüntüleme deneyler, yani yüksek edinme oranları 3 farklı aşamada dakikada 2 SD-TIRF görüntü yığınları gibi gerçekleştirmek için uygun bir yapılandırmadaki ilk başarılı uygulanması sunuldu Toplam 168 kare (yaklaşık 3 kare / saniye), karşılık gelen pozisyonlar, satın alınan. Vardı birkaç SD-TIRF mikroskoplar, daha önce12,13, ağırlıklı olarak hangi hücresel süreçler 3D …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Biz büyük ölçüde bilimsel topluluk, Üniversitesi Tıp Merkezi Hamburg-bize örnek değerlendirme için destek için Eppendorf teşekkür ederim. Yani, biz Sabine Windhorst NIH3T3 hücrelerin, Andrea Mordhorst YFP-Vinculin için ve Maren Rudolph RFP Lifeact için teşekkür ederim.
Materials
| Microscope and accessories | |||
| SD-TIRF microscope | Visitron Systems | ||
| Ti with perfect focus system | Nikon | Inverted microscope stand | |
| CSU-W1 T2 | Yokogawa | Spinning disk unit in dual-camera configuration | |
| iLAS2 | Roper Scientific | TIRF/FRAP scanner | |
| Evolve | Photometrix | EM-CCD cameras | |
| PiezoZ stage | Ludl Electronic Products | Motorized Z stage | |
| Bioprecision2 XY stage | Ludl Electronic Products | Motorized XY stage | |
| Stage top incubation chamber | Okolab | Bold Line | Temperature, CO2 and humidity supply |
| Cell culture | |||
| HeLa cervical cancer cells | DSMZ | ACC-57 | |
| NIH3T3 fibroblasts | DSMZ | ACC-59 | |
| Dulbecco's phosphate buffered saline (PBS) | Gibco | 14190144 | |
| Trypsin-EDTA 0.05% | Gibco | 25300054 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium + GlutaMAX-I (DMEM) | Gibco | 31966-021 | |
| OptiMEM | Gibco | 31985070 | Reduced serum medium |
| Fetal calf serum (FCS) | Gibco | 10500064 | |
| Penicillin/Streptomycin (PenStrep) | Gibco | 15140148 | |
| Full growth medium (DMEM supplemented with 10% FCS and 1% PenStrep) | |||
| TurboFect | ThermoFisher Scientific | R0531 | Transfection reagent |
| Ascorbic acid (AA) | Sigma | A544-25G | |
| 6-well cell culture plate | Sarstedt | 83.392 | |
| Glass bottom dishes | MatTek | P35G-1.5-10-C | 35mm, 0.17mm glass coverslip |
| Fibronectin, bovine plasma | ThermoFisher Scientific | 33010018 | |
| Neubauer improved chamber | VWR | 631-0696 | |
| TetraSpeck beads | ThermoFisher Scientific | T7279 | |
| Plasmids | |||
| RFP-Lifeact | Maren Rudolph, Institute of Medical Microbiology, University Medical Center Hamburg Eppendorf, Germany | ||
| YFP-Vinculin | Andrea Mordhorst, Institute of Medical Microbiology, University Medical Center Hamburg Eppendorf, Germany | ||
| Software and plugins | |||
| VisiView | Visitron Systems | Version 3 | |
| ImageJ | Version 1.52c | ||
| Turboreg plugin | http://bigwww.epfl.ch/thevenaz/turboreg/ | ||
| Macro "SD-TIRF_helper_JoVE.ijm" | this publication | https://github.com/bzobiak/ImageJ | |
| Volocity | PerkinElmer | Version 6.2.2 |
References
- Hell, S. W., Wichmann, J. Breaking the diffraction resolution limit by stimulated emission: stimulated-emission-depletion fluorescence microscopy. Optics Letters. 19 (11), 780 (1994).
- Gustafsson, M. G. L. Surpassing the lateral resolution limit by a factor of two using structured illumination microscopy. Journal of Microscopy. 198 (2), 82-87 (2000).
- Betzig, E., et al. Imaging intracellular fluorescent proteins at nanometer resolution. Science. 313 (5793), 1642-1645 (2006).
- Hess, S. T., Girirajan, T. P. K., Mason, M. D. Ultra-high resolution imaging by fluorescence photoactivation localization microscopy. Biophysical Journal. 91 (11), 4258-4272 (2006).
- Rust, M. J., Bates, M., Zhuang, X. Sub-diffraction-limit imaging by stochastic optical reconstruction microscopy (STORM). Nature methods. 3 (10), 793-796 (2006).
- van de Linde, S., et al. Direct stochastic optical reconstruction microscopy with standard fluorescent probes. Nature protocols. 6 (7), 991-1009 (2011).
- Zobiak, B., Failla, A. V. Advanced spinning disk-TIRF microscopy for faster imaging of the cell interior and the plasma membrane. Journal of Microscopy. 269 (3), 282-290 (2018).
- Mattheyses, A. L., Simon, S. M., Rappoport, J. Z. Imaging with total internal reflection fluorescence microscopy for the cell biologist. Journal of Cell Science. 123 (21), 3621-3628 (2010).
- Burchfield, J. G., Lopez, J. A., Vallotton, P., William, E. Exocytotic vesicle behaviour assessed by total internal reflection fluorescence microscopy. Traffic. 11 (4), 429-439 (2010).
- Oreopoulos, J., Berman, R., Browne, M. Spinning-disk confocal microscopy. present technology and future trends. Methods in Cell Biology. 123, 153-175 (2014).
- Murray, J. M., Appleton, P. L., Swedlow, J. R., Waters, J. C. Evaluating performance in three-dimensional fluorescence microscopy. Journal of Microscopy. 228 (3), 390-405 (2007).
- Trache, A., Lim, S. -. M. Integrated microscopy for real-time imaging of mechanotransduction studies in live cells. Journal of Biomedical Optics. 14 (3), 034024 (2009).
- Stehbens, S., Pemble, H., Murrow, L., Wittmann, T. Imaging intracellular protein dynamics by spinning disk confocal microscopy. Methods in Enzymology. , 293-313 (2012).
- Waldchen, S., Lehmann, J., Klein, T., Van De Linde, S., Sauer, M. Light-induced cell damage in live-cell super-resolution microscopy. Scientific Reports. 5, 1-12 (2015).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Thévenaz, P., Ruttimann, U. E., Unser, M. A pyramid approach to subpixel registration based on intensity. IEEE Transactions on Image Processing. 7 (1), 27-41 (1998).
- Partridge, M. A. Initiation of attachment and generation of mature focal adhesions by integrin-containing filopodia in cell spreading. Molecular Biology of the Cell. 17 (10), (2006).
- Dubin-Thaler, B. J., Giannone, G., Döbereiner, H. G., Sheetz, M. P. Nanometer analysis of cell spreading on matrix-coated surfaces reveals two distinct cell states and STEPs. Biophysical Journal. 86 (3), 1794-1806 (2004).
- Choi, C. K., Vicente-Manzanares, M., Zareno, J., Whitmore, L. A., Mogilner, A., Horwitz, A. R. Actin and α-actinin orchestrate the assembly and maturation of nascent adhesions in a myosin II motor-independent manner. Nature Cell Biology. 10 (9), 1039-1050 (2008).
- Bachir, A. I., Zareno, J., Moissoglu, K., Plow, E. F., Gratton, E., Horwitz, A. R. Integrin-associated complexes form hierarchically with variable stoichiometry in nascent adhesions. Current Biology. 24 (16), 1845-1853 (2014).
- Sun, Z., Guo, S. S., Fässler, R. Integrin-mediated mechanotransduction. Journal of Cell Biology. 215 (4), 445-456 (2016).
- Shao, L., Kner, P., Rego, E. H., Gustafsson, M. G. L. Super-resolution 3D microscopy of live whole cells using structured illumination. Nat. Methods. 8 (12), 1044-1046 (2011).
- Chen, B. -. C., et al. Lattice light-sheet microscopy: Imaging molecules to embryos at high spatiotemporal resolution. Science. 346 (6208), 1257998-1257998 (2014).
- Fu, Y., Winter, P. W., Rojas, R., Wang, V., McAuliffe, M., Patterson, G. H. Axial superresolution via multiangle TIRF microscopy with sequential imaging and photobleaching. Proceedings of the National Academy of Sciences. 113 (16), 4368-4373 (2016).
- Boulanger, J., et al. Fast high-resolution 3D total internal reflection fluorescence microscopy by incidence angle scanning and azimuthal averaging. Proceedings of the National Academy of Sciences. 111 (48), 17164-17169 (2014).
