Analys av skjuvning flöde-inducerad Migration av murin marginella zon B-celler In Vitro
Summary
Marginella zon B celler (MZBs) svarar på styrkan av skjuvning flöde genom att omorientera sina migreringssökväg upp flödet. Detta protokoll visar hur att registrera och analysera migreringen med hjälp av en flödesteknik enhet, pump, Mikroskop bildsystem och fri programvara.
Abstract
Marginella zon B celler (MZBs) är en population av B-celler som finns i de mus mjälten marginella zoner som omsluter folliklar. För att nå hårsäckarna, måste MZBs migrera upp tvärkraften av blodflödet. Vi presenterar här en metod för att analysera detta flöde-inducerad MZB migration in vitro. Första är MZBs isolerade från mus mjälte. MZBs är andra bosatte sig på integrin ligander i flow avdelningen bilder, utsatt om du vill skeva flöde och avbildas i Mikroskop medan migrera. Tredje, bilder av de migrerar MZBs bearbetas med cellen MTrack2 automatisk spårning plugin för ImageJ, och de resulterande cellen spår kvantifieras med hjälp av verktyget Ibidi Kemotaxis. Migreringsdata avslöja hur snabbt flytta cellerna, hur ofta de ändrar riktning, om skjuvning flöde vektorn påverkar deras migration riktning och som integrin ligander är inblandade. Även om vi använder MZBs, kan metoden enkelt anpassas för att analysera migration av alla leukocyter som svarar på styrkan av skjuvning flöde.
Introduction
Immuncellerna är de mest motila cellerna i människokroppen och ofta måste brottas med tvärkraften från blod och lymfa flödet. Men finns det förhållandevis få studier om shear kraft-inducerad migration av leukocyter1,2,3,4,5. Vi presenterar här ett tillförlitliga och kvantitativa protokoll för att analysera en immunceller reagerar på flödet in vitro. Utför analysen kräver inte tillverkning av komponenter och all utrustning och förbrukningsvaror är kommersiellt tillgängliga. Protokollet, inklusive cell rening och migration analys, kan utföras på en enda dag. Slutligen, även om vi beskriver migrering av marginella zon B-celler (MZBs), protokollet kan anpassas för att analysera migration mot flödet av andra typer av immunceller. Därför är det möjligt att använda denna analys att systematiskt analysera ett stort antal leukocyter med en heltäckande panel av villkor.
MZBs är en population av B-celler som i musen, finns bara i mjälte och transfer mellan insidan av folliklar och den marginella zoner6,7,8,9. Den marginella zon är ett lager av immunceller cirka 5 – 10 celler tjocka. Celllagrar omsluter hårsäcken och består främst av MZBs och makrofager men också invariant naturliga killer (iNKT) celler, dendritiska celler (DCs) och neutrofiler, bland annat10. Cellerna i den marginella zon utsätts för enkelriktad blodflödet med ursprung från mjälten artärer som avslutar i en marginell sinus som omger follikeln. Blodet rinner från hål i marginell sinus genom den marginella zon och sedan samlas i venös bihålor i röda massan och återställas till omsättning11. Gratis-flödet av blod sköljer över MZBs och utsätter dem för antigener som transporteras i blodet. MZBs bär antigenet i follikeln genom shuttling automatiskt mellan den marginella zon och inuti follikeln, som inte utsätts för blod. Således som MZBs flygplatstransfer mot follikeln, måste de migrera upp tvärkraften av blod flöde12 (figur 1A).
I detta protokoll, beskrivs hur man kvantitativt bestämma hur immunsystemet celler som MZBs besvara antingen inget flöde eller högt flöde in vitro-, för att avslöja hur de är programmerade för att migrera in vivo. I det första steget renas MZBs från en mus mjälte med magnetiska pärlor kopplat till antikroppar från kommersiellt tillgängliga kit. De färska isolerad MZBs är införs i brunnen av en flöde kammare bild, får sedimentera på integrin ligander och utsätts för flödet av migration buffert med ett pumpsystem (figur 2A). Cellerna är avbildade med hjälp av en time-lapse video mikroskopi system. Bilderna bearbetas sedan för analys med en gratis ImageJ plugin, MTrack213,14, att automatiskt spåra cellerna. Spår kan då kvantifieras med gratis Ibidi Chemotaxis verktyg15 att bestämma olika parametrar inklusive hastighet, rakhet och migration index. Dessa värden kan användas för att avgöra effekterna av migration-hämmare, cell stimulatorer, chemokiner och andra migration-påverkar kemikalier för skjuvning-flöde inducerad migration för att förstå de krafter som styr immunceller rörelse i vivo.
Protocol
Representative Results
Discussion
Här beskriver vi en metod för att analysera migration av celler som upptäcka styrkan av skjuvning flöde och svara genom att ändra deras migration. En analys av MZBs visade att MZBs migrera spontant på ICAM-1 och i närvaro av flödet, kommer att flytta upp flödet. I vårt tidigare arbete visade vi att MZBs inte flyttar upp flödet på VCAM-1 men istället vara fast på plats. Murina mjälten marginell zonen innehåller främst ICAM-1, medan den röda massan innehåller både ICAM-1 och VCAM-1. Från dessa data, ku…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Detta arbete stöds av bidrag från ”Deutsche Forschungsgemeinschafts” SFB 854/TP11 till K.-D.F.
Materials
| VWR Cell Strainer, 70 µm | VWR | 10199-656 |
| Pre-Separation Filters, 30 µm | Miltenyi | 130-095-823 |
| MZB and FOB cell isolation kit | Miltenyi | 130-100-366 |
| B220 CD45R, clone RA3-6B2, FITC | Biolegend | 103206 |
| CD21 / CD 35, clone 7G6, APC | BD Biosciences | 558658 |
| CD23, clone B3B4, PE | Biolegend | 101608 |
| HBSS | Biochrom | L2035 |
| D-PBS 1x | Gibco by Life Technologies | 14190-094 |
| BSA albumin fraction V, fatty acid-free | Roth | "0052.3" |
| ICAM-1 | R&D Systems | 796-IC-050 |
| Ibidi µ-slides VI 0.4, hydrophobic, uncoated | Ibidi | 80601 |
| Perfusion set, white, 50 cm, 0.8 mm | Ibidi | 10963 |
| Ibidi Pump system | Ibidi | 10902 |
Riferimenti
- Alon, R., Ley, K. Cells on the run: shear-regulated integrin activation in leukocyte rolling and arrest on endothelial cells. Current Opinions in Cell Biology. 20 (5), 525-532 (2008).
- Dominguez, G. A., Anderson, N. R., Hammer, D. A. The direction of migration of T-lymphocytes under flow depends upon which adhesion receptors are engaged. Integrative Biology (Cambridge). 7 (3), 345-355 (2015).
- Steiner, O., et al. Differential roles for endothelial ICAM-1, ICAM-2, and VCAM-1 in shear-resistant T cell arrest, polarization, and directed crawling on blood-brain barrier endothelium. Journal of Immunology. 185 (8), 4846-4855 (2010).
- Valignat, M. P., Theodoly, O., Gucciardi, A., Hogg, N., Lellouch, A. C. T lymphocytes orient against the direction of fluid flow during LFA-1-mediated migration. Biophysical Journal. 104 (2), 322-331 (2013).
- Woolf, E., et al. Lymph node chemokines promote sustained T lymphocyte motility without triggering stable integrin adhesiveness in the absence of shear forces. Nature Immunology. 8 (10), 1076-1085 (2007).
- Cinamon, G., et al. Sphingosine 1-phosphate receptor 1 promotes B cell localization in the splenic marginal zone. Nature Immunology. 5 (7), 713-720 (2004).
- Cinamon, G., Zachariah, M. A., Lam, O. M., Foss, F. W., Cyster, J. G. Follicular shuttling of marginal zone B cells facilitates antigen transport. Nature Immunology. 9 (1), 54-62 (2008).
- Cyster, J. G., Schwab, S. R. Sphingosine-1-phosphate and lymphocyte egress from lymphoid organs. Annual Reviews in Immunology. 30, 69-94 (2012).
- Schwab, S. R., Cyster, J. G. Finding a way out: lymphocyte egress from lymphoid organs. Nature Immunology. 8 (12), 1295-1301 (2007).
- Cerutti, A., Cols, M., Puga, I. Marginal zone B cells: virtues of innate-like antibody-producing lymphocytes. Nature Reviews Immunology. 13 (2), 118-132 (2013).
- Mebius, R. E., Kraal, G. Structure and function of the spleen. Nature Reviews Immunology. 5 (8), 606-616 (2005).
- Tedford, K., et al. The opposing forces of shear flow and sphingosine-1-phosphate control marginal zone B cell shuttling. Nature Communications. 8 (1), 2261 (2017).
- ImageJ. MTrack2 Available from: https://imagej.net/MTrack2 (2018)
- . MTrack2 Available from: https://valelab4.ucsf.edu/~nstuurman/IJplugins/MTrack2.html (2018)
- . Chemotaxis and Migration Tool Available from: https://ibidi.com/chemotaxis-analysis/171-chemotaxis-and-migration-tool.html (2018)
- Reeves, J. P., Reeves, P. A. Removal of lymphoid organs. Current Protocols in Immunology. , (2001).
- . Manual Tracking Available from: https://imagej.nih.gov/ij/plugins/manual-tracking.html (2018)
- . ibidi Pump System Available from: https://ibidi.com/perfusion-system/112-ibidi-pump-system.html (2018)
