Подготовка прокариот и эукариот организмов, с использованием химических сушки для морфологического анализа в растровая электронная микроскопия (SEM)
Summary
SEM анализ является эффективным методом для помощи в идентификации видов или фенотипические дискриминации. Этот протокол описывает методы для изучения морфологические особенности трех представительных видов организмов и будет широко применяться для изучения особенностей многие научные и типы тканей.
Abstract
Сканирующая электронная микроскопия (SEM) является метод широко доступны, который был применен для изучения биологических образцов, начиная от индивидуальных белков клеток, тканей, органеллы, и даже целые организмы. Этот протокол фокусируется на двух химических методов сушки, Гексаметилдисилазан (ГМДО) и t бутиловый спирт (TBA) и их применение к визуализации прокариот и эукариот организмов, используя SEM. В этой статье мы опишем, как исправить, мыть, обезвоживанию, сухой, монтировать, распыления Пальто и изображения трех видов организмов: цианобактерий (Toxifilum mysidocida, Golenkina sp. и неизвестных sp.), два euglenoids из рода Monomorphina (М. aenigmatica и м. pseudopyrum) и плодовой мушки (Drosophila melanogaster). Цель настоящего Протокола заключается в быстрый, недорогой и простой способ для получения подробной информации о структуре, размер и характеристики поверхности образцов, которые могут широко применяться для широкого спектра видов организмов для описания морфологической оценки. Успешное завершение этого протокола позволит другим пользователям использовать SEM для визуализации образцы, применяя эти методы для их системы.
Introduction
Сканирующий электронный микроскоп (SEM) использует фокусированный луч электронов для создания изображения из вторичных электронов, которые показывает, морфология и топографии образца1. SEM может использоваться непосредственно определить физический размер выборки, структура поверхности и трехмерную форму, и предлагает большее разрешение и более высокой глубине резкости по сравнению с световой микроскопии. Еще одной формой электронной микроскопии (EM), просвечивающей электронной микроскопии (ТЕА) использует целенаправленный электронов, которые проходят через образец, генерации изображения с мелких деталей внутренней структуры. ТЕА имеет высокое разрешение, чем свет или SEM и может быть использован для разрешения структуры как единого атомов, у него есть три основных недостатка: обширные пробоподготовки, небольшое поле зрения и глубине поля2,3. Хотя другие визуализирована протоколы существуют с помощью SEM для изучения конкретных ячеек, органеллы или ткани4,5,6,7,8,9, 10 , этот протокол является уникальным в том, что мы описываем методы, которые могут широко применяться для широкого спектра видов организмов для морфологической оценки.
SEM нашла широкое применение для изучения неорганических материалов, включая наночастиц11,12, полимеры13и многочисленные приложения в геологических, промышленных и материальной науки14, 15,16. В биологии SEM уже давно используется как метод для изучения биологических образцов от индивидуальных белков до всего организмов17,18. SEM имеет особое значение, потому что морфологические поверхности детали могут использоваться для информирования научных открытий. SEM анализ-это быстрый, недорогой и простой способ для получения подробной информации о структуре, размер и характеристики поверхности широкого спектра биологических образцов.
Потому что SEM обычно работает под высоким вакуумом (10-6 Торр минимум) для поддержки согласованного луча высокоскоростной электронов, без жидкостей (воды, масла, спирты), допускаются в палате образец, как жидкости предотвратить вакуум от формирования. Таким образом все образцы, рассмотрели, с использованием SEM должны обезвоженной, обычно с помощью градуированных этанола серии последовал процесс сушки для удаления этанола. Существует несколько способов сушки биологических тканей для использования в SEM, включая воздушной сушки, лиофилизация, использования критической точки сушки (CPD) устройства, или химического вещества, сушки, используя t бутиловый спирт (TBA) или Гексаметилдисилазан (ГМДО)19, 20 , 21 , 22. наиболее часто, выбор метода сушки эмпирические, поскольку каждый биологический образец может по-разному реагируют на каждый метод сушки. Для любого заданного образца все эти методы могут быть уместно, поэтому сравнивать преимущества и недостатки каждого из них является полезным при выборе соответствующего метода.
В то время как воздушной сушки образца при комнатной температуре или в сушильной печи (60 ° C) является самым простым методом, большинство биологических образцов показывают сушки индуцированных повреждений, таких как съежившегося и крах, что приводит к деформации образца. Процесс лиофилизации также удаляет воду (или льда) от образца, но требует образцы для флэш замороженные и помещен под вакуумом для удаления льда через процесс сублимации, потенциально опасных образца. Кроме того пользователь должен иметь доступ к лиофилизатор. Наиболее часто используемый метод для обезвоживания проб для SEM является критической точкой сушки (CPD)). В ДСП этанола в образец заменяется с жидкой двуокиси углерода (CO2) и при определенной температуре и условий давления, известный как критической точки (31,1 ° C и 1,073 psi), CO2 испаряется, тем самым создавая поверхностное натяжение, эффективное поддержание морфологических и структурных особенностей образца. В то время как ДСП, как правило, является стандартным методом, он имеет несколько недостатков. Во-первых этот процесс требует доступа к критической точки осушитель, который не только дорогой, но также требует использования жидкой двуокиси углерода. Во-вторых размер образца, который можно сушить ограничен размер камеры сушки критической точки. В-третьих обмен жидкости во время CPD может вызвать турбулентность, которая может повредить образец.
Химические сушки предлагает много преимуществ по сравнению с ДСП и служит подходящей альтернативой, которая становится широко используется в SEM пробоподготовки. Использование химических dehydrants ТБА и HMDS предлагает быстрый, недорогой и простой альтернативой другим методам, сохраняя при этом структурной целостности образца. Недавно мы показали, что нет никакой разницы в целостности тканей или качество конечного изображения, захваченные при использовании ДСП или TBA как метод сушки в взрослых дрозофилы ткани сетчатки23. В отличие от ДСП TBA и HMDS не требуют сушки инструмента или жидкие CO2 , и нет никаких ограничений на размер образца, чтобы высушить. Помимо получения химических веществ, для завершения процесса сушки требуются только стандартный Химический вытяжной шкаф и соответствующие средства индивидуальной защиты (перчатки, лабораторный халат и защитные очки). Хотя та и HMDS легковоспламеняющиеся, TBA менее токсичные и менее дорогим (примерно 1/3 стоимости ГМДО) чем HMDS.
В этой статье мы опишем, как исправить, мыть, обезвоживанию, сухой, монтировать, распыления Пальто и изображения трех видов организмов: цианобактерий (Toxifilum mysidocida, Golenkina sp. и неизвестных sp.), два euglenoids из рода Monomorphina (М. aenigmatica и м. pseudopyrum) и плодовой мушки (Drosophila melanogaster). Эти организмы представляют широкий диапазон в размер (0,5 мкм до 4 мм) и клеточных разнообразия (одиночные celled для многоклеточных), но все легко поддаются анализу SEM с только небольшие изменения, необходимые для подготовки образцов. Этот протокол описывает методы для использования химических обезвоживания и SEM анализ для изучения морфологических детали трех видов организмов и будет широко применяться для изучения многие научные и типы тканей.
Protocol
Representative Results
Discussion
Здесь мы описали протокол, с помощью SEM для получения подробной информации о внешних морфологических характеристик трех видов организмов, которые другие могут применять для изучения особенностей многих видов организмов или тканей. В каждом шаге протокола существует потенциальных точ…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа финансировалась Грант MLS и награды академии летний Мак от управления исследований и аспирантуру в Центральный Мичиганский университет. Цианобактерии были поставлены Zimba и планктона лаборатории, частью центра для прибрежных исследований, Texas A & M University в Корпус-Кристи. Euglenoids были поставлены в лаборатории Triemer, Университет штата Мичиган.
Materials
| gold–palladium | Ted Pella, Inc. | 91212 | |
| Silver conductive adhesive 503 | Electron Microscopy Sciences | 12686-15 | |
| Whatman Nuclepore Track-Etched Membranes; diam. 25 mm, pore size 8 μm, polycarbonate | Sigma | WHA110614 | |
| Whatman Nuclepore Track-Etched Membranes; diam. 25 mm, pore size 0.8 μm, polycarbonate, black | Sigma | WHA110659 | |
| Whatman Nuclepore Track-Etched Membranes; diam. 25 mm, pore size 0.2 μm, polycarbonate | Sigma | WHA110606 | |
| aluminum weighing dish | Fisher Scientific | 08-732-100 | |
| aluminum mounting stubs (12 mm) | Electron Microscopy Sciences | 75210 | |
| aluminum mounting stubs (25 mm) | Electron Microscopy Sciences | 75186 | |
| Adhesive tabs | Electron Microscopy Sciences | 76760 | |
| conductive carbon adhesive tabs | Electron Microscopy Sciences | 77825 | |
| F/2 media | Culture Collection of Algae at the University of Texas at Austin | https://utex.org/products/f_2-medium | No Catalog number given – see link |
| AF6 media | Bigelow – National Center for Marin Algae and Microbiota | https://ncma.bigelow.org/media/wysiwyg/Algal_recipes/NCMA_algal_medium_AF6_1.pdf | No Catalog number given – see link |
| Soil water medium | Carolina Biological Supply Company | 153785 | |
| Polyethylene glycol tert-octylphenyl ether (Triton X-100) | VWR | 97062-208 | |
| Hummer 6.2 Sputter Coater | Anatech USA | http://www.anatechusa.com/hummer-sputter-systems/4 | No Catalog number given – see link |
| Hitachi 3400N-II SEM | Hitachi | https://www.hitachi-hightech.com/us/product_list/?ld=sms2&md=sms2-1&sd=sms2-1-2&gclid=EAIaIQobChMIpq_jtJfj3AIVS7jACh2mdgkPEAAYASAAEgKAnfD_BwE | The company doesn't appear to sell this model any longer |
Riferimenti
- Bozzola, J. J., Russell, L. D. . Electron microscopy, principles and techniques for biologists. , (1999).
- Goldstein, J., et al. . Scanning electron microscopy and X-ray microanalysis. , (2003).
- Egerton, R. F. . Physical principles of electron microscopy: an introduction to TEM, SEM, and AEM. , (2005).
- Mukherjee, K., et al. Analysis of Brain Mitochondria Using Serial Block-Face Scanning Electron Microscopy. Journal of visualized experiments. (113), (2016).
- Bello, M. A., Ruiz-Leon, Y., Sandoval-Sierra, J. V., Rezinciuc, S., Dieguez-Uribeondo, J. Scanning Electron Microscopy (SEM) Protocols for Problematic Plant, Oomycete, and Fungal Samples. Journal of visualized experiments. (120), (2017).
- Ramirez-Esquivel, F., Ribi, W. A., Narendra, A. Techniques for Investigating the Anatomy of the Ant Visual System. Journal of visualized experiments. (129), (2017).
- Endres, B., et al. A Protocol to Characterize the Morphological Changes of Clostridium difficile in Response to Antibiotic Treatment. Journal of visualized experiments. (123), (2017).
- Chan, V. B., et al. Characterization of Calcification Events Using Live Optical and Electron Microscopy Techniques in a Marine Tubeworm. Journal of visualized experiments. (120), (2017).
- Miquel Guennoc, ., C, , et al. A New Method for Qualitative Multi-scale Analysis of Bacterial Biofilms on Filamentous Fungal Colonies Using Confocal and Electron Microscopy. Journal of visualized experiments. (119), (2017).
- Bucher, T., Kartvelishvily, E., Kolodkin-Gal, I. Methodologies for Studying B. subtilis Biofilms as a Model for Characterizing Small Molecule Biofilm Inhibitors. Journal of visualized experiments. (116), (2016).
- Thompson, Z. S., Rijal, N. P., Jarvis, D., Edwards, A., Bhattarai, N. Synthesis of Keratin-based Nanofiber for Biomedical Engineering. Journal of visualized experiments. (108), e53381 (2016).
- Ponce, A., Mejia-Rosales, S., Jose-Yacaman, M. Scanning transmission electron microscopy methods for the analysis of nanoparticles. Methods in Molecular Biology. , 453-471 (2012).
- Wang, X. S., Tang, H. P., Li, X. D., Hua, X. Investigations on the mechanical properties of conducting polymer coating-substrate structures and their influencing factors. International Journal of Molecular Sciences. 10 (12), 5257-5284 (2009).
- Hortola, P. SEM examination of human erythrocytes in uncoated bloodstains on stone: use of conventional as environmental-like SEM in a soft biological tissue (and hard inorganic material). Journal of Microscopy. 218 (Pt 2), 94-103 (2005).
- Joy, D. C. Scanning electron microscopy for materials characterization. Current Opinion in Solid State and Materials Science. 2 (4), 465-468 (1997).
- Tsikouras, B., Pe-Piper, G., Piper, D. J. W., Schaffer, M. Varietal heavy mineral analysis of sediment provenance, Lower Cretaceous Scotian Basin, eastern Canada. Sedimentary Geology. 237 (3-4), 150-165 (2011).
- Goldberg, M. W., Fiserova, J. Immunogold Labeling for Scanning Electron Microscopy. Methods in Molecular Biology. 1474, 309-325 (2016).
- Hall, D. H., Hartwieg, E., Nguyen, K. C. Modern electron microscopy methods for C. elegans. Methods in Cell Biology. 107, 93-149 (2012).
- Heegaard, S., Jensen, O. A., Prause, J. U. Hexamethyldisilazane in preparation of retinal tissue for scanning electron microscopy. Ophthalmic Research. 18 (4), 203-208 (1986).
- Nation, J. L. A new method using hexamethyldisilazane for preparation of soft insect tissues for scanning electron microscopy. Stain Technology. 58 (6), 347-351 (1983).
- Wolff, T. . Preparation of Drosophila eye specimens for scanning electron microscopy. 2011 (11), 1383-1385 (2011).
- Fischer, E. R., Hansen, B. T., Nair, V., Hoyt, F. H., Dorward, D. W. Scanning electron microscopy. Current Protocols in Microbiology. , (2012).
- Trotter, M. B., Stephens, T. D., McGrath, J. P., Steinhilb, M. L. The Drosophila model system to study tau action. Methods in Cell Biology. 141, 259-286 (2017).
- Guillard, R. R., Ryther, J. H. Studies of marine planktonic diatoms. I. Cyclotella nana Hustedt, and Detonula confervacea (cleve) Gran. Canadian Journal of Microbiology. 8, 229-239 (1962).
- Guillard, R. R. L. . Culture of Marine Invertebrate Animals. , (1975).
- Watanabe, M. M., Kawachi, M., Hiroki, M., Kasai, F. . National Institute for Environmental Studies. , 159 (1997).
- Inoue, T., Osatake, H. A new drying method of biological specimens for scanning electron microscopy: the t-butyl alcohol freeze-drying method. Archives of Histology and Cytology. 51 (1), 53-59 (1988).
- Zurawell, R. W., Chen, H., Burke, J. M., Prepas, E. E. Hepatotoxic cyanobacteria: a review of the biological importance of microcystins in freshwater environments. Journal of Toxicology and Environmental Health. Part B, Critical Reviews. 8 (1), 1-37 (2005).
- Berman-Frank, I., Lundgren, P., Falkowski, P. Nitrogen fixation and photosynthetic oxygen evolution in cyanobacteria. Research in Microbiology. 154 (3), 157-164 (2003).
- Silva Rocha, B., Carneiro, F. M. How many species of Cyanobacteria are there? Using a discovery curve to predict the species number. Biodiversity and Conservation. (22), 2907-2918 (2013).
- Robins, R. J., Hall, D. O., Shi, D. J., Turner, R. J., Rhodes, M. J. C. Mucilage acts to adhere cyanobacteria and cultured plant cells to biological and inert surfaces. FEMS Microbiology Letters. (34), 155-160 (1986).
- Diestra, E., et al. Characterization of an oil-degrading Microcoleus consortium by means of confocal scanning microscopy, scanning electron microscopy and transmission electron microscopy. Scanning. 27 (4), 176-180 (2005).
- Komárek, J. Modern taxonomic revision of planktic nostocacean cyanobacteria: a short review of genera. Hydrobiologia. 639 (639), 231-243 (2010).
- Leander, B. S., Farmer, M. A. Comparative morphology of the euglenid pellicle. I. Patterns of strips and pores. The Journal of Eukaryotic Microbiology. 47 (5), 469-479 (2000).
- Leander, B. S., Farmer, M. A. Comparative morphology of the euglenid pellicle. II. Diversity of strip substructure. The Journal of Eukaryotic Microbiology. 48 (2), 202-217 (2001).
- Leander, B. S., Witek, R. P., Farmer, M. A. Trends in the evolution of the euglenid pellicle. Evolution. 55 (11), 2215-2235 (2001).
- Shulman, J. M., Feany, M. B. Genetic modifiers of tauopathy in Drosophila. Genetica. 165 (3), 1233-1242 (2003).
- Reinecke, J. B., et al. Implicating calpain in tau-mediated toxicity in vivo. PLoS One. 6 (8), e23865 (2011).
