Her, er en protokol om beskyttelse af DNA origami nanostrukturer i Mg-forarmet og nukleasen-rige medier ved hjælp af naturlige kationiske polysaccharid chitosan og syntetiske lineære polyethyleneimine (LPEI) belægninger præsenteret.
DNA origami nanostrukturer holde en enorme potentiale til at blive anvendt til biologiske og medicinske applikationer. Men lav-salt betingelser og nukleaser i fysiologiske væsker fremkalde denaturering og nedbrydning af selvsamlede DNA-nanostrukturer. I ikke-virale gen levering, er Enzymatisk nedbrydning af DNA overvældet af indkapsling af den negativt ladede DNA i en kationiske shell. Heri, inspireret af genet levering fremskridt, en enkel, one-step og robust metode præsenteres for stabilisering af DNA origami nanostrukturer med belægning dem med chitosan og lineær polyethyleneimine. Polycation Belægningen beskytter effektivt DNA origami nanostrukturer i Mg-forarmet og nukleasen-rige medier. Denne metode bevarer også den fulde adresserbarhed af enzym – og aptamer-baseret functionalization af DNA nanostrukturer.
DNA er en alsidig byggesten for de programmerbare samlesæt af nanoskala strukturer1. Den mest populære metode til at oprette DNA nanostrukturer er DNA origami teknik, som er baseret på den samlesæt i en lang cirkulær, enkelt strandede DNA stillads ved hjælp af hundredvis af kortere form-bestemmende syntetiske korte strands2. I dag, er oprettelsen af DNA nanostrukturer i næsten enhver geometri og morfologi, der umiddelbart gennemførlig. DNA nanostrukturer kan være site-specifically functionalized med høj præcision3,4 og kan programmeres til at gennemgå allosteriske konformationelle ændringer5,6. Derfor, ved hjælp af DNA som byggemateriale tilbyder en unik mulighed for at oprette programmerbare og lydhør specialdesignede nanostrukturer til applikationer i biosensing, diagnostik og medicinafgivelse. Men DNA nanostrukturer er modtagelige for fordøjelsen af exo– og endo-nukleaser og gitter-baseret 3D DNA origami nanostrukturer generelt kræver høj saltholdighed buffere (fx., 5-20 mM Mg+ 2) til at opretholde deres integritet7,8.
Den hurtige nedbrydning af DNA ved nukleaser stede i blod og den ekstracellulære matrix er en væsentlig hindring for effektiv i vivo -levering af genetiske produkter i celler9. For at overvinde denne begrænsning, i ikke-virale gen levering, er DNA blandet med en kationiske polymer på en defineret N/P afgift ratio (forholdet mellem aminer i polycation til fosfater i DNA)10. Komplekset af DNA med en kationiske polymer, kendt som polyplex, beskytter DNA fra nukleasen-medieret nedbrydning og øger dets cellulære optagelse11. Inspireret af genet levering fremskridt, oligolysine12, oligolysine-polyethylen glycol (PEG) copolymerer13, poly (2-dimethylamino-ethylmethacrylate) (PDMAEMA)-baserede polymerer14, og virus kapsid proteiner15 har været brugt til stabiliserende DNA origami nanostrukturer.
For nylig, vi rapporterede en metode til beskyttelse af DNA origami nanostrukturer i Mg-forarmet og nukleasen-rige medier ved hjælp af naturlige kationiske polysaccharid chitosan og den syntetiske lineære polyethyleneimine (LPEI) blev rapporteret16. Denne artikel er en tilpasning af vores tidligere arbejde og beskriver de detaljerede protokol for forberedelse af polyplexes, deres karakterisering, afprøvning stabilitet af nøgne og beskyttede nanostrukturer i lav-salt og nukleasen-rige medier og undersøge den adresserbarhed af enzym – og aptamer-functionalized DNA origami nanostrukturer ved polycation belægning.
I den samlesæt DNA origami, de korte tråde er typisk tilføjet i 5-10 overskydende forholdet til skafottet. Disse overskydende korte tråde også binde sig til den polycation og form polyplexes i rækken monometer, som er yderligere vanskeligt kan adskilles fra DNA origami polyplexes. Dermed er et afgørende skridt i polyplex dannelse at fjerne de overskydende korte tråde og bruge godt oprenset DNA origami nanostrukturer.
Andre metoder har været udviklet til stabiliserende DNA nanostrukturer såsom cyclization af DNA-strenge, via et klik reaktion26. Som alkyn og indeholder modificerede korte tråde er nødvendige for dannelsen af låst enkeltstrenget ringe, denne teknik er begrænset til stabilisering af små nanostrukturer DNA catenane, og det er ikke let skalerbart til større DNA origami struktur som dem der bruges i denne protokol. For nylig, Gerling et enl.27 rapporterede en metode til at skabe kovalente cyclobutene pyrimidin dimer (CPD) obligationer mellem tilstødende thymidines inden for DNA nanostrukturer ved hjælp af ultraviolet bestråling. Selvom denne metode er site-selektive og skalerbar, er dens effektivitet i at beskytte DNA origami meget lavere end polycation belægning. For eksempel, udholde CPD-stabiliseret DNA origami objekter kun 0,4 U/mL DNase jeg for 1 h, mens polyplexes var stabil i 10 U/mL DNase jeg mindst én dag.
Kort sagt, genterapi inspireret chitosan og LPEI belægning er en low-cost, one-step og effektiv metode til at behandle den langsigtede stabilitet af DNA origami nanostrukturer i Mg-forarmet og nukleasen-rige medier. Reversibilitet af polyplex dannelsen letter sin ansøgning i flere trin diagnostiske tests hvor beskyttelse af DNA origami mod nucleolytic nedbrydning eller salt-udtynding er afgørende i ét trin, men kan forårsage problemer i andre foranstaltninger såsom DNA forstærkning. Derudover er polycation belægning en potentiel tilgang for at øge den cellulære optagelse af DNA origami nanostrukturer til medicinafgivelse programmer28.
The authors have nothing to disclose.
Dette projekt har modtaget støtte fra EUs Horisont 2020 forskning og innovation program under grant aftale nr. 686647. TEM billeder blev optaget på en Morgagni drives på 80 kV på EM anlægget af Wien Biocenter Core faciliteter GmbH (VBCF). Vi vil gerne takke Tadija Kekic for assistance i grafisk design og Elisa De LIano til at designe wireframe nanostrukturer.
10× DNase I reaction buffer | New England Biolab (NEB) | B0303 | |
ABTS (2′-Azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid) diammonium salt) | Alfa Aesar | J65535 | |
Amicon ultracentrifugation columns | Merck Millipore | UCF500308, UCF510024 | |
Chitosan oligosaccharide lactate (Mn ~ 4000-6000, > 90% deacetylated, 60%. composition oligosaccharide | Sigma-Aldrich | 523682 | |
Design-specific staple strands | Integrate DNA Technologies (IDT) | ||
Dextran sulfate sodium salt (Mr ~ 4 kDa) | Sigma-Aldrich | 75027 | |
Dextran sulfate sodium salt (Mr ~ 40 kDa) | Sigma-Aldrich | 42867 | |
DNA gel loading dye (6×) | ThermoFischer sceintific | R0611 | |
DNase I (RNase free) | New England Biolab (NEB) | M0303 | |
Ethylene glycol-bis(2-aminoethylether)-N,N,N′,N′-tetraacetic acid (EGTA) | Sigma-Aldrich | E3889 | |
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) BioUltra, anhydrous, ≥99% (titration) | Sigma-Aldrich | EDS | |
Freeze'N Squeeze DNA Gel Extraction Spin Columns | Biorad | 7326165 | |
Hemin | Sigma-Aldrich | H9039 | |
HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
Hydrogen peroixde slution (32 wt%) | Sigma-Aldrich | 216763 | |
LPEI-25 kDa | Polysciences, Inc | 23966-1 | |
NuPAGE Sample Reducing Agent (500 mM dithiothreitol (DTT)) | ThermoFischer sceintific | NP0004 | |
Polyethylene glycol (PEG, MW ~ 8000 Da) | Carl Roth | O263.1 | |
Polyethylenimine, linear, average Mn 10,000, PDI ≤1.2 | Sigma-Aldrich | 765090 | |
Polyethylenimine, linear, average Mn 5,000, PDI ≤1.3 | Sigma-Aldrich | 764582 | |
Proteinase K solution (20 mg/ml) | ThermoFischer sceintific | AM2548 | |
Streptavidin-conjugated HRP | ThermoFischer sceintific | N100 | |
SYBER safe DNA gel stain | ThermoFischer sceintific | S33102 |