यहां, एमजी में डीएनए origami nanostructures के संरक्षण के लिए एक प्रोटोकॉल समाप्त हो गया और nuclease-प्राकृतिक cationic polysaccharide chitosan और सिंथेटिक रैखिक polyethyleneimine (LPEI) कोटिंग्स का उपयोग कर अमीर मीडिया प्रस्तुत किया है ।
डीएनए origami nanostructures एक अपार क्षमता पकड़ जैविक और चिकित्सा अनुप्रयोगों के लिए इस्तेमाल किया जा करने के लिए । हालांकि, कम नमक की स्थिति और शारीरिक तरल पदार्थ में nucleases विकार और आत्म इकट्ठे डीएनए nanostructures के क्षरण के लिए प्रेरित । गैर वायरल जीन डिलिवरी में, डीएनए के एंजाइमी क्षरण एक cationic खोल में नकारात्मक आरोप डीएनए के encapsulation से दूर है । इस के साथ साथ, जीन प्रसव प्रगति, एक सरल, एक कदम और मजबूत पद्धति से प्रेरित डीएनए origami nanostructures के स्थिरीकरण के लिए उंहें chitosan और रैखिक polyethyleneimine के साथ कोटिंग द्वारा प्रस्तुत किया है । polycation कोटिंग कुशलतापूर्वक एमजी-घट और nuclease-रिच मीडिया में डीएनए origami nanostructures की रक्षा करता है । यह विधि भी एंजाइम की पूर्ण पता और डीएनए nanostructures के aptamer आधारित functionalization को बरकरार रखता है ।
डीएनए नेनो संरचनाओं1के प्रोग्राम स्व-विधानसभा के लिए एक बहुमुखी इमारत ब्लॉक है । डीएनए nanostructures बनाने के लिए सबसे लोकप्रिय तरीका डीएनए origami तकनीक है, जो स्वयं पर आधारित है एक लंबे परिपत्र के विधानसभा, एकल असहाय डीएनए पाड़ छोटे आकार के सैकड़ों की सहायता के साथ सिंथेटिक स्टेपल किस्में2का निर्धारण । आज, डीएनए nanostructures का निर्माण लगभग किसी भी ज्यामिति और आकृति विज्ञान में आसानी से संभव है । डीएनए nanostructures साइट हो सकता है-विशेष रूप से उच्च परिशुद्धता के साथ कार्यात्मक3,4 और allosteric के गठन के परिवर्तन से गुजरना क्रमादेशित किया जा सकता है5,6। इसलिए, एक निर्माण सामग्री के रूप में डीएनए का उपयोग कर अद्वितीय संवेदन, निदान और दवा वितरण में अनुप्रयोगों के लिए प्रोग्राम और उत्तरदायी कस्टम डिजाइन nanostructures बनाने का अवसर प्रदान करता है । हालांकि, डीएनए nanostructures exoद्वारा पाचन के लिए अतिसंवेदनशील होते है-और इंडो-nucleases, और जाली आधारित 3 डी डीएनए origami nanostructures आम तौर पर उच्च लवणता बफ़र्स (जैसे, 5-20 mM मिलीग्राम+ 2) की आवश्यकता को बनाए रखने के लिए अपने निष्ठा7,8.
रक्त में मौजूद nucleases द्वारा डीएनए का तेजी से क्षरण और extracellular मैट्रिक्स9कोशिकाओं में आनुवंशिक उत्पादों के वितरण vivo में कुशल करने के लिए एक बड़ी बाधा है । इस सीमा पर काबू पाने के लिए, गैर वायरल जीन डिलीवरी में, डीएनए एक cationic बहुलक के साथ एक परिभाषित एन/पी चार्ज अनुपात में मिलाया जाता है (polycation में डीएनए में फॉस्फेट्स के अनुपात)10। एक cationic बहुलक के साथ डीएनए के परिसर, polyplex के रूप में जाना जाता है, nuclease-मध्यस्थता क्षरण से डीएनए की रक्षा और अपनी सेलुलर वृद्धि11बढ़ाता है । जीन डिलिवरी प्रगति से प्रेरित, oligolysine12, oligolysine-पॉलीथीन ग्लाइकोल (खूंटी) copolymers13, पाली (2-dimethylamino-ethylmethacrylate) (PDMAEMA)-आधारित पॉलिमर14, और वायरस कैप्सिड प्रोटीन15 डीएनए origami nanostructures स्थिर करने के लिए इस्तेमाल किया गया है ।
हाल ही में, हम डीएनए origami nanostructures के संरक्षण के लिए एक विधि की सूचना दी मिलीग्राम-घट और nuclease-रिच प्राकृतिक cationic polysaccharide chitosan और सिंथेटिक रैखिक polyethyleneimine (LPEI) का उपयोग कर मीडिया16बताया गया था । यह लेख हमारे पहले काम का एक अनुकूलन है और polyplexes की तैयारी के लिए विस्तृत प्रोटोकॉल का वर्णन, उनके लक्षण वर्णन, नग्न और संरक्षित nanostructures में कम नमक और nuclease अमीर मीडिया की स्थिरता का परीक्षण और जांच एंजाइम की पता-और aptamer कार्यात्मक polycation कोटिंग पर डीएनए origami nanostructures ।
आत्म-डीएनए origami के विधानसभा में, प्रधान किस्में आम तौर पर पाड़ को 5-10 अतिरिक्त अनुपात में जोड़ रहे हैं । ये अतिरिक्त प्रधान किस्में भी monometer रेंज में polycation और फॉर्मल polyplexes को बाँधती हैं जो आगे चलकर मुश्किल से डीएनए origami polyplexes से अलग हो जाती हैं. इसलिए, polyplex गठन में एक महत्वपूर्ण कदम अतिरिक्त प्रधान किस्में हटाने और अच्छी तरह से शुद्ध डीएनए origami nanostructures का उपयोग करने के लिए है ।
अंय तरीकों से एक क्लिक प्रतिक्रिया26के माध्यम से डीएनए किस्में के cyclization जैसे डीएनए nanostructures स्थिर करने के लिए विकसित किया गया है । के रूप में alkyne-और azide-संशोधित स्टेपल किस्में इंटरलॉकिंग एकल-असहाय छल्ले के गठन के लिए आवश्यक हैं, इस तकनीक छोटे nanostructures के स्थिरीकरण ऐसे डीएनए catenane के लिए सीमित है, और यह बड़ा डीएनए origami के लिए आसानी से स्केलेबल नहीं है इस प्रोटोकॉल में उपयोग किए गए लोगों के रूप में संरचना । हाल ही में, Gerling एट एएल27 आबंध cyclobutene न्यूक्लियोटाइड डिमर (सीपीडी) डीएनए thymidines में पराबैंगनी विकिरण का उपयोग कर के भीतर पड़ोसी nanostructures के बीच बांड बनाने के लिए एक विधि की सूचना दी । हालांकि इस विधि साइट चयनात्मक और स्केलेबल है, डीएनए origami की रक्षा में अपनी दक्षता polycation कोटिंग की तुलना में बहुत कम है । उदाहरण के लिए, सीपीडी-स्थिर डीएनए origami वस्तुओं केवल ०.४ यू/एमएल DNase मैं 1 घंटे के लिए सहना, जबकि polyplexes 10 यू/एमएल DNase मैं कम एक दिन के लिए की उपस्थिति में स्थिर थे ।
संक्षेप में, जीन थेरेपी प्रेरित chitosan और LPEI कोटिंग एक कम लागत, एक कदम और कुशल विधि के लिए डीएनए origami nanostructures की दीर्घकालिक स्थिरता का पता है Mg-घट और nuclease-रिच मीडिया । polyplex गठन की reversibility बहु-चरणीय नैदानिक परीक्षणों में अपने आवेदन की सुविधा देती है जहां nucleolytic क्षरण या नमक-घट के विरुद्ध डीएनए origami की सुरक्षा एक कदम में महत्वपूर्ण है लेकिन अन्य चरणों में ऐसी समस्या पैदा हो सकती है जैसे डीएनए प्रवर्धन. साथ ही, polycation कोटिंग के लिए एक संभावित दृष्टिकोण है सेलुलर बढ़ाने के लिए डीएनए origami nanostructures दवा वितरण अनुप्रयोगों के लिए28.
The authors have nothing to disclose.
इस परियोजना को अनुदान समझौते सं ६८६६४७ के तहत यूरोपीय संघ के क्षितिज २०२० अनुसंधान और नवाचार कार्यक्रम से धन प्राप्त हुआ है. उनि छवियां एक Morgagni पर दर्ज की गई ८० एम पर संचालित वियना के लिए केंद्र की सुविधा GmbH (VBCF) । हम चित्रमय डिजाइन में सहायता के लिए Tadija Kekic और एलिसा De LIano वायरफ़्रेम nanostructure डिजाइनिंग के लिए धंयवाद देना चाहूंगा ।
10× DNase I reaction buffer | New England Biolab (NEB) | B0303 | |
ABTS (2′-Azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid) diammonium salt) | Alfa Aesar | J65535 | |
Amicon ultracentrifugation columns | Merck Millipore | UCF500308, UCF510024 | |
Chitosan oligosaccharide lactate (Mn ~ 4000-6000, > 90% deacetylated, 60%. composition oligosaccharide | Sigma-Aldrich | 523682 | |
Design-specific staple strands | Integrate DNA Technologies (IDT) | ||
Dextran sulfate sodium salt (Mr ~ 4 kDa) | Sigma-Aldrich | 75027 | |
Dextran sulfate sodium salt (Mr ~ 40 kDa) | Sigma-Aldrich | 42867 | |
DNA gel loading dye (6×) | ThermoFischer sceintific | R0611 | |
DNase I (RNase free) | New England Biolab (NEB) | M0303 | |
Ethylene glycol-bis(2-aminoethylether)-N,N,N′,N′-tetraacetic acid (EGTA) | Sigma-Aldrich | E3889 | |
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) BioUltra, anhydrous, ≥99% (titration) | Sigma-Aldrich | EDS | |
Freeze'N Squeeze DNA Gel Extraction Spin Columns | Biorad | 7326165 | |
Hemin | Sigma-Aldrich | H9039 | |
HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
Hydrogen peroixde slution (32 wt%) | Sigma-Aldrich | 216763 | |
LPEI-25 kDa | Polysciences, Inc | 23966-1 | |
NuPAGE Sample Reducing Agent (500 mM dithiothreitol (DTT)) | ThermoFischer sceintific | NP0004 | |
Polyethylene glycol (PEG, MW ~ 8000 Da) | Carl Roth | O263.1 | |
Polyethylenimine, linear, average Mn 10,000, PDI ≤1.2 | Sigma-Aldrich | 765090 | |
Polyethylenimine, linear, average Mn 5,000, PDI ≤1.3 | Sigma-Aldrich | 764582 | |
Proteinase K solution (20 mg/ml) | ThermoFischer sceintific | AM2548 | |
Streptavidin-conjugated HRP | ThermoFischer sceintific | N100 | |
SYBER safe DNA gel stain | ThermoFischer sceintific | S33102 |