Här presenteras ett protokoll för att skydda DNA origami nanostrukturer i Mg-utarmat och nuclease-rich media med naturliga katjoniska polysackarid chitosan och syntetiska linjära polyethyleneimine (LPEI) beläggningar.
DNA origami nanostrukturer håller en enorm potential att användas för biologiska och medicinska tillämpningar. Dock inducerar låg salthalt villkor och nukleaser i fysiologiska vätskor denaturering och nedbrytning av själv monterade DNA nanostrukturer. I icke-virala gen leverans, är enzymatiska nedbrytningen av DNA betagen av inkapsling av negativt laddade DNA i ett katjonaktiva skal. Häri, inspirerad av gen leverans framsteg, en enkel, one-step och robust metod presenteras för stabiliseringen av DNA origami nanostrukturer genom att täcka dem med chitosan och linjär polyethyleneimine. Polycation beläggningen skyddar effektivt DNA origami nanostrukturer i Mg-utarmat och nuclease-rika medier. Denna metod bevarar också den fullständiga adressering av enzym – och aptamer-baserade funktionalisering av DNA nanostrukturer.
DNA är en mångsidig byggsten för de programmerbara självmontering av nanoskala strukturer1. Den mest populära metoden för att skapa DNA nanostrukturer är den DNA-origami-teknik, som bygger på den självmontering av en lång cirkulär, enda stranded DNA strandar Rullställning med hjälp av hundratals kortare form-bestämma syntetiska stapelvara2. Idag är skapandet av DNA nanostrukturer nästan alla geometri och morfologi lätt genomförbart. DNA nanostrukturer kan vara anläggningsvis functionalized med hög precision3,4 och kan programmeras att genomgå Alloster konfirmerande ändringar5,6. Därför erbjuder använda DNA som byggnadsmaterial en unik möjlighet att skapa programmerbara och lyhörd specialdesignade nanostrukturer för applikationer i biosensing, diagnostik och läkemedel. Men DNA nanostrukturer är mottagliga för matsmältningen av exo– och endo-nukleaser och galler-baserat 3D DNA origami nanostrukturer kräver i allmänhet hög salthalt buffertar (t.ex., 5-20 mM Mg+ 2) att upprätthålla sin integritet7,8.
Den snabba nedbrytningen av DNA av nukleaser närvarande i blodet och den extracellular matrisen är ett stort hinder för effektiva i vivo leverans av genetiska produkter in i celler9. För att övervinna denna begränsning, icke-viral genen leveransen, blandas DNA med en katjoniska polymer ett definierade N/P avgift baserat (förhållandet mellan aminer i polycation till fosfater i DNA)10. Komplex av DNA med en katjoniska polymer, känd som polyplex, skyddar DNA från nuclease-medierad nedbrytning och förbättrar dess cellernas upptag11. Inspirerad av gen leverans framsteg, oligolysine12, oligolysine-polyetylen glykol (PEG) sampolymerer13, poly (2-dimethylamino-ethylmethacrylate) (PDMAEMA)-baserade polymerer14, och virus kapsid proteiner15 har använts för att stabilisera DNA origami nanostrukturer.
Nyligen rapporterade vi en metod för skydd av DNA origami nanostrukturer i Mg-utarmat och nuclease-rich media med den naturliga katjoniska polysackarid chitosan och den syntetiska linjära polyethyleneimine (LPEI) var rapporterade16. Denna artikel är en anpassning av vårt tidigare arbete och beskriver det detaljerade protokollet för beredning av polyplexes, deras karakterisering, testa stabiliteten i naken och skyddade nanostrukturer i låg salthalt och nuclease-rika medier och undersöka den adressering av enzym – och aptamer-functionalized DNA origami nanostrukturer vid polycation beläggning.
I den självmontering av DNA-origami, krampa trådar vanligtvis läggs i 5-10 överskott förhållande till schavotten. Dessa överskott krampa trådar binder också till den polycation och bildar polyplexes i intervallet monometer som ytterligare är svårt att skiljas från DNA origami polyplexes. Därmed är ett avgörande steg i polyplex bildandet att ta bort överflödig krampa trådar och använda väl renat DNA origami nanostrukturer.
Andra metoder har utvecklats för att stabilisera DNA nanostrukturer såsom ringbildning av DNA-strängar via ett klick reaktion26. Som alkynen – och natriumazid-modifierade krampa delarna krävs för bildandet av förreglad enkelsträngat ringar, denna teknik är begränsad för stabiliseringen av små nanostrukturer sådan en DNA-catenane, och det är inte lätt skalbar för större DNA-origami struktur som används i detta protokoll. Nyligen, Gerling et enl.27 rapporterade en metod för att skapa kovalent cyclobutene pyrimidin dimer (CPD) obligationer mellan närliggande thymidines inom DNA nanostrukturer med ultraviolett bestrålning. Även om denna metod är webbplats-selektiv och skalbar, är dess effektivitet för att skydda DNA-origami mycket lägre än polycation beläggning. Till exempel uthärda CPD-stabiliserad DNA origami objekt bara 0.4 U/mL DNAS jag för 1 h, medan polyplexes var stabil i närvaro av 10 U/mL DNAS jag för minst en dag.
I korthet, genterapi inspirerad chitosan och LPEI beläggning är en låg kostnad, one-step och effektiv metod att ta itu med DNA origami nanostrukturer i Mg-utarmat och nuclease-rika medier långsiktiga stabilitet. Reversibiliteten av polyplex bildandet underlättar dess tillämpning i flera steg diagnostiska tester där skydd av DNA-origami mot nucleolytic nedbrytning eller salt-utarmning är avgörande i ett steg men kan orsaka problem i andra åtgärder såsom DNA förstärkning. Dessutom är polycation beläggning en potentiell strategi för att öka cellulära upptaget av DNA origami nanostrukturer för drog-leverans program28.
The authors have nothing to disclose.
Detta projekt har fått finansiering från EU: s Horizon 2020 forskning och innovation program under lån avtal nr 686647. TEM bilder har spelats in på en Morgagni som drivs på 80 kV vid EM anläggningen av den Vienna Biocenter Core faciliteter GmbH (VBCF). Vi vill tacka Tadija Kekic för bistånd i grafisk design och Elisa De LIano för att utforma wireframe nanostrukturen.
10× DNase I reaction buffer | New England Biolab (NEB) | B0303 | |
ABTS (2′-Azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid) diammonium salt) | Alfa Aesar | J65535 | |
Amicon ultracentrifugation columns | Merck Millipore | UCF500308, UCF510024 | |
Chitosan oligosaccharide lactate (Mn ~ 4000-6000, > 90% deacetylated, 60%. composition oligosaccharide | Sigma-Aldrich | 523682 | |
Design-specific staple strands | Integrate DNA Technologies (IDT) | ||
Dextran sulfate sodium salt (Mr ~ 4 kDa) | Sigma-Aldrich | 75027 | |
Dextran sulfate sodium salt (Mr ~ 40 kDa) | Sigma-Aldrich | 42867 | |
DNA gel loading dye (6×) | ThermoFischer sceintific | R0611 | |
DNase I (RNase free) | New England Biolab (NEB) | M0303 | |
Ethylene glycol-bis(2-aminoethylether)-N,N,N′,N′-tetraacetic acid (EGTA) | Sigma-Aldrich | E3889 | |
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) BioUltra, anhydrous, ≥99% (titration) | Sigma-Aldrich | EDS | |
Freeze'N Squeeze DNA Gel Extraction Spin Columns | Biorad | 7326165 | |
Hemin | Sigma-Aldrich | H9039 | |
HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
Hydrogen peroixde slution (32 wt%) | Sigma-Aldrich | 216763 | |
LPEI-25 kDa | Polysciences, Inc | 23966-1 | |
NuPAGE Sample Reducing Agent (500 mM dithiothreitol (DTT)) | ThermoFischer sceintific | NP0004 | |
Polyethylene glycol (PEG, MW ~ 8000 Da) | Carl Roth | O263.1 | |
Polyethylenimine, linear, average Mn 10,000, PDI ≤1.2 | Sigma-Aldrich | 765090 | |
Polyethylenimine, linear, average Mn 5,000, PDI ≤1.3 | Sigma-Aldrich | 764582 | |
Proteinase K solution (20 mg/ml) | ThermoFischer sceintific | AM2548 | |
Streptavidin-conjugated HRP | ThermoFischer sceintific | N100 | |
SYBER safe DNA gel stain | ThermoFischer sceintific | S33102 |