En sfäroid dödande analys av CAR T-celler

Summary

Detta protokoll syftar till att bedöma immunoterapeutisk omdirigerade T-cell (bil T-cell) cytotoxicitet mot 3D strukturerad cancerceller (spheroids) i realtid.

Abstract

Immunterapi har blivit en växande intresseområde i kampen mot cancer annars behandlingsbar. Bland alla immunoterapeutisk metoder Omdirigerad chimära antigen receptorn (bil) T-celler som erhållits de mest spektakulära resultat, särskilt med pediatric B-akut lymfoblastisk leukemi (B-ALL). Klassiskt valideringsmetoder av CAR T-celler är beroende av användningen av specificitet och funktionalitet analyser av bil T-cellerna mot målceller i suspension och xenograft-modeller. Tyvärr iakttagelser in vitro-decoupleds ofta från resultat erhållna i vivo och en hel del ansträngning och djur kunde besparas genom att lägga till ytterligare ett steg: användning av 3D kultur. Produktionen av spheroids av potentiella målceller som efterliknar 3D-strukturen för tumörcellerna när de är rekonstituerades in i djurens modellen utgör ett perfekt alternativ. Här rapporterar vi en prisvärd, tillförlitlig och enkel metod för att producera spheroids från en sensorik kolorektal cellinje som ett valideringsverktyg för adoptiv cellterapi (exemplifieras här med CD19 CAR T-celler). Denna metod är tillsammans med en avancerad live imaging system som kan följa sfäroid tillväxt, effektor celler cytotoxicitet och tumör cell apoptos.

Introduction

Adoptiv cell överföring (ACT) representerar nästa generation cancerbehandling. Det bygger på en injektion av effektor celler (T – eller NK-celler) i en patient. Dessa celler kan vara genetiskt modifierade med en receptor som kommer att vägleda dem till deras mål, tumören, och förstöra den. Nyligen visade denna strategi sig vara genomförbart när en chimär Antigen receptorn (bil) riktade mot B-cell markören CD19 introducerades in i patienten T cellerna att döda sin cancer¹. När det gäller bil, som är en konstgjord receptor, konstruktionen består av specifika antikroppsfragment, antigenet bindande domän minskas till en entitet utsedda enda kedja variabel fragment (scFv), kopplade till T-cell signalering domäner. Det finns flera utföranden, de vanligaste versionerna avses som andra generationens bildesign, består av CD3z för TCR signalering och en co-stimulatory domän (CD28, 4-1BB, OX40, etc.) ^{1 , 2}. fältet immunterapi riktas de flesta av dess uppmärksamhet till denna nya form av ACT när CD19 bil-T-celler efficaciously behandlat många patienter med B-cell maligniteter^3,4. Efter denna framgång, forskare försökt att utnyttja de liknande mönster genom att rikta andra epitoper för solida tumörer med begränsad framgång. Tyvärr, bristen på tumör specifika antigener och de hårdare tumör mikromiljö renderade bil T celler mindre effektivt mot solida tumörer⁵.

För närvarande är lita de vanligaste i vitro validering strategierna på tvådimensionell (2D) system som endast behandlar ett fragment av de redan nämnda solid tumör utmaningarna. Klassiskt, innebära 2D in vitro- system en blandning av CAR T-celler och målet cancer cellinjer som enskiktslager att bedöma funktionalitet och specificitet av dessa effektor celler. Även om dessa strategier är viktigt och avgörande delar av studierna, de inte beakta den komplexa morfologi och tredimensionella (3D) struktur av cancer celler⁶. Cancerceller odlade i 3D system, kallad spheroids, förvärva nya fenotypiska egenskaper genom förändringar i genen uttryck profil⁷, som kan påverka erkännande av omdirigerade effektor celler. Birgersdotter och kollegor har visat att en Hodgkins lymfom (HL) cell fodrar när endast odlas i 3D kultur modell förvärvar en profil av gen-uttryck som liknar primärtumör prover⁸. Därför kultur spheroids eller liknande 3D metoder erbjuda mer relevant i vitro modeller i motsats till vanliga 2D-system. Sådana system liknar också in vivo-studier som ses som det sista steget i valideringen av en viss bil. Med tanke på att 2D-system misslyckas med att härma morfologi av cancer kluster, spheroids erbjuda liknande formationer för att utvärdera funktionaliteten i CAR T-celler före in vivo modeller. I en studie, Pickl et al. identifierade att en sfäroid modell av human epidermal tillväxtfaktor receptor (HER2) överuttryck cancerceller visat liknande signalering profiler till i vivo modeller⁹. Detta stöder ytterligare att spheroids erbjuda mer relevant och nära-till-in vivo bedömning av bil T-cellerna. Dessutom bil T-cell validering mot spheroids kan hjälpa bedöma deras effekt mer kritiskt och att några av formgivningarna flyttas till studier i förtid¹⁰; således bidrar till etiskt berörda forskningen genom att offra färre djur. Dessutom är protokoll använder spheroids inte dyrare än klassiskt 2D-system och mycket snabbare jämfört med klassiska in-vivo studier. Sammantaget kan man förutse att införandet av sfäroid studier snart blir praxis att länka in vitro- och in vivo studier.

Här presenterar vi beredning av spheroids från kolon cancer cell fodrar HCT 116. Denna cellinje ändrades för att uttrycka mänskliga CD19 molekylen att återge det känsliga för CD19 CAR T-celler och ge en tydlig bedömning av dödandet med en kliniskt validerade bil konstruktion.

Protocol

1. generering av Spheroids från kolorektal Cancer cellinje Tvätta HCT 116 (stabilt sensorik för att uttrycka kluster av differentiering 19 (CD19) och grönt fluorescerande Protein (GFP)) cell enskiktslager med fosfat buffrad koksaltlösning (PBS; 5 mL för en 25 cm2 eller 10 mL för en 75 cm2 kolv). Lägg till trypsin (0,5 mL för en 25 cm2 eller 1 mL för en 75 cm2 kolv) och inkubera cellerna vid 37 ° C i 5 min. Kontrollera cellen lossnar under ett mikr…

Representative Results

Som kan ses i figur 1, är det viktigt att kontrollera av flödescytometri graden av uttryck av CD19 bil på T-celler (figur 1A) och nivån av CD19 på HCT116 tumör cellinjer (figur 1B). Figur 2 exemplifierar resultatet av en typisk sfäroid experiment. Automatiserad bildbehandling apparaten tar bilder i fyra olika kanaler: ljusa fält, fas, grön och röd fluorescens. …

Discussion

Användningen av spheroids som ett innovativt verktyg för att validera framtida cancerbehandling har blivit en växande intresseområde under de senaste åren. Spheroids utgör ett mellansteg mellan klassisk 2D in vitro-analys och i vivo bedömning. Metoden ytterligare rymmer en hel del löfte angående deras styrka i form av tumör mikro-miljö härma samt gen profilering⁷. Det protokoll som presenteras i denna publikation var anpassad från Saheen et al.¹¹ till …

Materials

Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline	SIGMA-ALDRICH	D8537-500ML	Lot Number: RNBG7037
75 cm² growth area flasks	VWR	430639	Lot Number: 2218002
75 cm² growth area flasks	VWR	734-2705	Lot Number: 3718006
Trypsin-EDTA	SIGM-ALDRICH	T3924-100ml	Lot Number: SLBTO777
RPMI 1640 med L-glutamin, 10 x 500 ml	Life Technology (Gibco)	21875-091	Lot Number: 1926384
Fetal Bovine Serum	Gibco	10500064	Lot Number: 08Q3066K
Gentamicin	Thermo Fischer	15750060	Lot Number: 1904924A
Trypan Blue Solution, 0.4%	Thermo Fischer	15250061	Lot Number: 1886513
96 well plate, round bottom	VWR	734-1797	Lot Number: 33117036
Dynabeads Human T-Activator CD3/CD28	Thermo Fischer	11132D	–
X-VIVO 15 with Gentamicin L-Gln, Phenol Red, 1 L	BioNordika	BE02-060Q	Lot Number: 8MB036
CTS Immune Cell Serum Replacement	Thermo Fischer	A2596102	Lot Number: 1939319
IL-2 Proleukin	Novartis		Lot Number: 505938M
IncuCyte Annexin V Red Reagent	Essen Bioscience	4641	Lot Number: 17A1025-122117
Reagent Reservoir	VWR	89094-672	Lot Number: 89094-672
15 ml tubes	VWR	734-1867	Lot Number: 19317044
anti-human CD19-PE	BD Biosciences	555413	Lot Number: 4016990 RRID: AB_395813
Biotin-SP (long spacer) AffiniPure F(ab')2 Fragment Goat Anti-Mouse IgG	Jackson ImmunoResearch	115-066-072	Lot Number: 129474: RRID: AB_2338583
Streptavidin-PE	BD Biosciences	554061	Lot Number: 5191579: RRID: AB_10053328
HCT 116 Colorectal Carcinoma Line	ATCC	CCL-247	–
Incucyte S3	Essen Bioscience