Структурно похожие белки часто оказывают различные биологические функции. Обмена эквивалентной регионов этих белков с целью создания химерных белки представляет собой новаторский подход для выявления критических белков регионов, которые отвечают за их функциональных различий.
Цель настоящего протокола включает в себя дизайн химерных белков, в которых отдельных регионах белка заменяются их соответствующих последовательностей в структурно аналогичных белка, с целью определения функциональной значимости этих регионов. Такие химер генерируются с помощью вложенных протокол постановки ПЦР с использованием перекрывающихся фрагментов ДНК и адекватно разработан грунтовки, а затем их выражение в рамках млекопитающих системы для обеспечения родной вторичной структуры и столб-поступательные изменения.
Функциональная роль различных региона обозначается затем потеря активности Химера в assay соответствующей индикации. В следствие определены регионы, укрывательство набор важнейших аминокислот, который может далее экранируется дополнительных методов (например , сайт Направленный мутагенез) для увеличения молекулярного разрешения. Хотя ограничиваться случаями, в которых можно найти структурно связанные белком с различными функциями, химерных белки с успехом используются для выявления критических привязки регионов в белках, таких как цитокинов и цитокина рецепторов. Этот метод особенно подходит в тех случаях, в которых белка функциональных регионов не будут четко определены и представляет собой ценный первый шаг в направленной эволюции подходов к сузить области интереса и уменьшить затраты скрининга.
Несколько видов белков, в том числе цитокинов и факторы роста, группируются в семьях, члены которых разделяют подобные трехмерной структуры, но часто оказывают различные биологические функции1,2. Это функциональное разнообразие обычно является следствием небольшие различия в аминокислотный состав внутри молекулы активных сайтов3. Выявление таких участков и функциональных детерминанты не только предлагают ценную эволюционной но также для разработки более конкретных агонисты и ингибиторы4. Однако большое количество различий в составе остатков, часто встречаются между структурно похожие белки усложняет эту задачу. Даже несмотря на то, что строительство большой библиотеки, содержащие сотни мутантов в настоящее время это возможно, оценки каждый один остаток вариации и комбинации из них по-прежнему остается сложным и отнимает много времени усилий5.
Методы оценки функциональной значимости регионов больших белка, таким образом, значение для уменьшения числа возможных остатков к управляемым число6. Усеченные белки были наиболее часто используемых подход к решению этой проблемы. Соответственно регионы считаются функционально актуальны, если функцию белка под исследования зависит от удаления конкретного региона7,8,9. Однако главным недостатком этого метода является, что удаления может повлиять на вторичную структуру белка, приводит к сворачиванию, агрегации и невозможность для изучения предполагаемого региона. Хорошим примером является усеченная версия цитокина oncostatin M (OSM), в котором внутреннего исключения, больше, чем 7 остатков привело к смятых мутантов, которые не могут быть в дальнейшем учился10.
Поколение химерных белков является альтернативной и новаторский подход, который позволяет анализ крупных областей белка. Цель данного метода является обмен регионы интереса в протеине, структурно связанных последовательностей в другой белок, чтобы оценить вклад замененных разделов для конкретных биологических функций. Широко используется в области сигнализации приемные устройства для определения функциональных областях11,12, химерных белки являются особенно полезными для изучения белков семей с мало аминокислоты личность, но сохраняется вторичной структуры. Соответствующие примеры можно найти в классе, интерлейкина-6 (IL-6) типа цитокинов, таких как интерлейкина-6 и цилиарной нейротрофических факторов (6% последовательности идентификаторов)13 или лейкемия ингибирующего фактор (LIF) и OSM (20% удостоверение)6, на котором основан после протокола.
Поколение химерных белков представляет универсальный метод, который может выйти за пределы усеченным белков на вопросы как модульность cytokine рецептор связывания доменов13. Дизайн химерами является ключевым шагом в такого рода исследований и требует тщательного рассмотре?…
The authors have nothing to disclose.
Эта работа была поддержана Общество Макса Планка и Schüchtermann-клиника (Бад-Ротенфельде, Германия). Часть этого исследования была опубликована в журнал биологической химии. Адриан Сегарра, ж. м., Шиндлер, н., Gajawada, P., Lörchner, ч., Браун, т. & Pöling, Дж. Цикл AB и D-спирали в привязки сайта III М человеческого Oncostatin (OSM) для активации рецептора OSM. J. Chem. биол. 2018; 18:7017-7029. © Авторы.
Labcycler thermocycler | Sensoquest | 011-103 | Any conventional PCR machine can be employed to carry out this protocol |
NanoDrop 2000c UV-Vis spectrophotometer | ThermoFisher Scientific | ND-2000C | DNA quantification |
GeneRuler 100 bp DNA ladder | ThermoFisher Scientific | SM0241 | |
GeneRuler DNA Ladder Mix | ThermoFisher Scientific | SM0331 | |
AscI restriction enzyme | New England Biolabs | R0558 | |
PacI restriction enzyme | New England Biolabs | R0547 | |
Phusion Hot Start II DNA Polymerase | ThermoFisher Scientific | F-549S | |
dNTP set (100 mM) | Invitrogen | 10297018 | |
T4 DNA ligase | Promega | M1804 | |
NucleoSpin Gel and PCR clean-up kit | Macherey-Nagel | 740609 | |
MGC Human LIF Sequence-Verified cDNA (CloneId:7939578), glycerol stock | ThermoFisher Scientific | MHS6278-202857165 | |
LE agarose | Biozym | 840004 | |
Primers | Sigma-Aldrich | Custom order | |
Human Oncostatin M cDNA | Gift of Dr. Heike Hermanns (Division of Hepatology, University Hospital Würzburg, Germany) | ||
pCAGGS vector with PacI and AscI restriction sites | Gift of Dr. André Schneider (Max Planck Institute for Heart and Lung Research, Bad Nauheim, Germany) |