Strukturelt relaterte proteiner utøve ofte forskjellige biologiske funksjoner. Utveksling av tilsvarende områder av disse proteinene vil opprette chimeric proteiner utgjør en innovativ tilnærming for å identifisere kritiske protein områder som er ansvarlig for deres funksjonelle divergens.
Målet med denne protokollen omfatter utformingen av chimeric proteiner som atskilte områder av et protein er erstattet med de tilsvarende sekvensene i en samme protein, for å fastslå funksjonelle betydningen av disse regionene. Slike chimeras genereres ved hjelp av en nestede PCR-protokoll overlappende DNA fragmenter og tilstrekkelig utviklet primere, etterfulgt av deres uttrykk innenfor et pattedyr system å sikre opprinnelige sekundære struktur og post-translasjonell modifikasjoner.
Funksjonell rolle en distinkt region angis deretter med tap av aktivitet chimera i riktig avlesning analysen. I følge identifiseres regioner huse en rekke kritiske aminosyrer, som kan bli ytterligere vist av komplementære teknikker (f.eks området-rettet mutagenese) for å øke molekylær oppløsning. Begrenset til saker som et strukturelt relaterte protein med ulike funksjoner kan bli funnet, har chimeric proteiner vært vellykket ansatt å identifisere kritiske bindende områder i proteiner som cytokiner og cytokin reseptorer. Denne metoden er spesielt godt egnet i tilfeller der den protein funksjonelle områder ikke er godt definert, og utgjør en verdifull første skritt i regissert utvikling tilnærminger til å begrense områdene rundt og redusere screening krefter involvert.
Flere typer proteiner, inkludert cytokiner og vekstfaktorer, er gruppert i familier hvis medlemmer dele lignende tredimensjonale strukturer, men ofte utøve forskjellige biologiske funksjoner1,2. Dette funksjonelle mangfoldet er vanligvis konsekvensen av små forskjeller i aminosyre komposisjon i molekylets aktive nettsteder3. Identifikasjon av slike nettsteder og funksjonelle determinanter ikke bare tilbyr verdifull evolusjonære innsikt men også utforme mer spesifikke agonister og hemmere4. Men kompliserer mange forskjeller i rester komposisjon ofte funnet mellom strukturelt relaterte proteiner denne oppgaven. Selv om bygge store biblioteker som inneholder hundrevis av mutanter er i dag mulig, vurdere hver enkelt rester Variant kombinasjoner av dem fortsatt en tidkrevende og utfordrende innsats5.
Teknikker vurdere funksjonelle betydningen av store protein regioner er dermed å redusere antall mulig rester til et håndterlig antall6. Avkortet proteiner er den mest brukte måten å håndtere dette problemet. Følgelig regnes områder være funksjonelt relevant hvis funksjonen protein under studien påvirkes av slettingen av en bestemt region7,8,9. En stor begrensning av denne metoden er imidlertid at slettinger kan påvirke protein’s sekundære struktur, fører til misfolding, aggregering og manglende evne til å studere den tiltenkte regionen. Et godt eksempel er en avkortet versjon av cytokin oncostatin M (OSM), som studerte en intern sletting større enn 7 rester resulterte i en misfolded mutant som ikke kunne ytterligere10.
Generering av chimeric proteiner utgjør en alternativ og nyskapende tilnærming som tillater analyse av større protein regioner. Målet med denne metoden er å utveksle områder av interesse i et protein av strukturelt relaterte sekvenser i en annen protein, for å vurdere bidrag erstattet delene til bestemte biologiske funksjoner. Mye brukt i feltet signalnettverk reseptorer å identifisere funksjonelle domener11,12, er chimeric proteiner spesielt nyttig å studere protein familier med liten aminosyre identitet men bevarte sekundære struktur. Aktuelle eksempler kan bli funnet i klassen av interleukin-6 (IL-6) type cytokiner, slik som interleukin-6 og ciliary nevrotropisk faktor (6% sekvens identitet)13 eller leukemi hemmende faktor (LIF) og OSM (20% identitet)6, som den etter protokoll basert.
Generering av chimeric proteiner utgjør en allsidig teknikk, hvilke er kjøpedyktig gå utover grensene for avkortet proteiner til adressen spørsmål som modularitet cytokin-reseptor bindende domener13. Utformingen av chimeras er et viktig skritt i denne typen studier, og krever nøye overveielse. Forstudier å etablere funksjonelle domener krever generelt substitusjon av brede områder i en første fase, mens mindre erstatninger med variabel lengde er mer egnet til detaljerte studier av ett. Sp…
The authors have nothing to disclose.
Dette arbeidet ble støttet av Max Planck samfunnet og Schüchtermann-klinikken (Bad Rothenfelde, Tyskland). En del av denne forskningen ble opprinnelig publisert i Journal of Biological Chemistry. Adrian-Segarra, J. M., Schindler, N., Gajawada, s., Lörchner, H., Braun, T. & Pöling, J. AB loop og D-helix i binding området III av menneskelig Oncostatin M (OSM) kreves for OSM reseptor aktivisering. J. Biol. kjemiske 2018; 18:7017-7029. © forfatterne.
Labcycler thermocycler | Sensoquest | 011-103 | Any conventional PCR machine can be employed to carry out this protocol |
NanoDrop 2000c UV-Vis spectrophotometer | ThermoFisher Scientific | ND-2000C | DNA quantification |
GeneRuler 100 bp DNA ladder | ThermoFisher Scientific | SM0241 | |
GeneRuler DNA Ladder Mix | ThermoFisher Scientific | SM0331 | |
AscI restriction enzyme | New England Biolabs | R0558 | |
PacI restriction enzyme | New England Biolabs | R0547 | |
Phusion Hot Start II DNA Polymerase | ThermoFisher Scientific | F-549S | |
dNTP set (100 mM) | Invitrogen | 10297018 | |
T4 DNA ligase | Promega | M1804 | |
NucleoSpin Gel and PCR clean-up kit | Macherey-Nagel | 740609 | |
MGC Human LIF Sequence-Verified cDNA (CloneId:7939578), glycerol stock | ThermoFisher Scientific | MHS6278-202857165 | |
LE agarose | Biozym | 840004 | |
Primers | Sigma-Aldrich | Custom order | |
Human Oncostatin M cDNA | Gift of Dr. Heike Hermanns (Division of Hepatology, University Hospital Würzburg, Germany) | ||
pCAGGS vector with PacI and AscI restriction sites | Gift of Dr. André Schneider (Max Planck Institute for Heart and Lung Research, Bad Nauheim, Germany) |