Zebrafiskar är modellsystem som har många värdefulla funktioner inklusive optisk klarhet, snabb extern utveckling, och av särskild betydelse inom hörsel och balans, externt belägna sensoriska hårcellerna. Denna artikel beskriver hur transgena zebrafiskar kan användas till assay både hår-cell mechanosensation och presynaptiska funktion i sin helhet.
Sensoriska hårcellerna är mekanoreceptorer i innerörat som krävs för hörsel och balans. Hårcellerna aktiveras som svar på sensoriska stimuli som mekaniskt avleder apikala utbuktningar kallas hår buntar. Nedböjning öppnar mechanotransduction (MET) kanaler i hår buntar, leder till ett inflöde av katjoner, inklusive kalcium. Detta ering inflöde depolarizes cellen och öppnar spänningskänsliga kalciumkanaler ligger basally vid den hår-cell presynapse. Hos däggdjur, hårcellerna är innesluten i ben, och det är utmanande att funktionellt bedöma dessa aktiviteter i vivo. Däremot larval zebrafiskar är transparenta och besitter ett externt belägna sidolinje organ som innehåller hårcellerna. Dessa hårceller funktionellt och strukturellt liknar hår däggdjursceller och kan bedömas funktionellt invivo. Denna artikel beskriver en teknik som använder en genetiskt kodade kalcium indikator (GECI), signaler GCaMP6s, att mäta stimulus-framkallat kalcium i zebrafiskar sidolinje hårcellerna. GCaMP6s kan användas, tillsammans med confocal imaging, för att mäta invivo kalcium signaler vid apex och bas av sidolinje hårcellerna. Dessa signaler ger en realtid, kvantifierbara avläsning av både mechanosensation – och presynapse-beroende kalcium verksamhet inom dessa hårceller. Dessa kalcium signaler ger också viktiga funktionella informationen om hur hårcellerna upptäcka och överför sensoriska stimuli. Sammantaget denna teknik skapar användbara data om relativa ändringar i kalcium aktivitet in vivo. Det är mindre väl lämpad för kvantifiering av den absoluta magnituden av kalcium förändringar. Denna invivo teknik är känsliga för rörelse artefakter. En rimlig praxis och skicklighet som krävs för korrekt positionering, immobilisering och stimulering av larver. Slutligen, när korrekt utförda, det protokoll som beskrivs i denna artikel ger ett kraftfullt sätt att samla in värdefull information om aktiviteten av hår-celler i sina naturliga, fullt integrerade inom ett levande djur.
Funktionella kalcium bildbehandling är ett kraftfullt verktyg som kan användas för att övervaka aktiviteten hos många celler samtidigt1. I synnerhet har kalcium bildåtergivning med genetiskt kodade kalcium indikatorer (GECIs) visat sig vara fördelaktiga eftersom GECIs kan uttryckas i specifika celltyper och lokaliserade subcellularly2. I neurovetenskap forskning, har dessa funktioner gjort kalcium bildåtergivning med GECIs en kraftfull metod att både definiera aktivitetsmönster inom neuronala nätverk och mäta kalcium tillströmningen vid enskilda synapserna3,4. Dra nytta av dessa funktioner, används konfokalmikroskopi och GECIs i en studie för att övervaka subcellulär aktivitet inom samlingar av sensoriska hårcellerna5.
Hårcellerna är de mekanoreceptorer att upptäcker ljud och vestibulära stimuli i innerörat och lokala vatten rörelse i sidolinje systemet i vattenlevande vetebrates6,7. Hårcellerna är ofta målet för skador eller genetiska mutationer som leder till den vanligaste formen av hörselnedsättning hos människor kallas sensorineural hörsel förlust8,9. Därför är det viktigt att förstå hur dessa celler fungerar för att förstå hur att behandla och förebygga hörselnedsättning. För att fungera korrekt, utnyttja hårcellerna två specialiserade strukturer som kallas mechanosensory-hår buntar och synaptic band att upptäcka och överföra stimuli, respektive. Hår buntar ligger vid spetsen av hårcellerna och består primärt av fina, hår-liknande utbuktningar kallas sinneshår (figur 1A). I vestibulära och sidolinje hårceller har varje hår bunt också en enda lång kinocilium (cellens enda sanna cilier), som kan sträcka sig långt ovanför sinneshår (figur 1A). Mechanosensory stimuli avleda hår buntar och avböjning sätter spänning på kopplingar kallas ”tip-länkar” som interconnect sinneshår10. Denna spänning öppnar mechanotransduction (MET) kanaler ligger i den sinneshår, vilket resulterar i en apikal tillströmning av katjoner, inklusive kalcium11,12. Denna apikala aktivitet i slutändan depolarizes cellen hår och öppnar spänningskänsliga kalciumkanaler (Cav1.3) vid basen av cellen. Cav1.3 kanaler hittas intill synaptic band, en presynaptiska struktur som tjuder blåsor på aktiva zoner. Basala kalcium inflöde genom Cav1.3 kanaler krävs för vesikler fusion, neurotransmission och aktivering av afferenta neuroner13,14.
För många år, elektrofysiologiska tekniker såsom hela-cell patch fastspänning har använts sond funktionella egenskaper av hårceller i många arter, inklusive zebrafiskar15,16,17, 18,19,20. Dessa elektrofysiologiska inspelningar har varit särskilt värdefulla i fälten hörsel och balans eftersom de kan användas för att få extremt känsliga mätningar från enskilda sensoriska celler, vars syfte är att koda extremt snabb stimuli över en brett spektrum av frekvenser och stödnivåer21,22. Tyvärr kan inte hela-cell inspelningar mäta aktiviteten av populationer av hårcellerna. För att studera aktiviteten av populationer av celler i zebrafiskar lateral-linjen, mikrofonkabelsystem potentialer och afferenta handlingspänningar som har använts för att mäta de summerade mechanosensitive och postsynaptiska svar egenskaper av enskilda neuromasts23 ,24. Tyvärr har varken hela-cell inspelningar eller potentiella lokala fältmätningar den rumsliga upplösningen att lokalisera där aktivitet sker inom enskilda celler eller mäta aktiviteten i varje cell inom en befolkning. Mer nyligen, kalcium färgämnen och GECIs har använts för att kringgå dessa utmaningar25,26.
I zebrafiskar, har GECIs visat sig vara en kraftfull metod att undersöka hår-cellernas funktion på grund av den relativa lätthet att skapa transgena zebrafiskar och optisk klarhet larver27. På zebrafiskar larver föreligger hårcellerna i innerörat samt sidolinje systemet. Den laterala linjen består av rosett-liknande kluster av hårceller som kallas neuromasts som används för att upptäcka lokala förändringar i vattnets rörelse (figur 1). Den laterala linjen är särskilt användbart eftersom det ligger externt längs ytan av fisken. Denna tillgång har gjort det möjligt att stimulera hårcellerna och mäta kalcium signaler optiskt i intakt larver. Användarvänlighet genmodifiering, öppenhet av larverna, och oöverträffad tillgång sidolinje hårcellerna har sammantaget gjort zebrafiskar en ovärderlig modell att studera aktiviteten av hårcellerna i vivo. Detta är en viktig fördel jämfört med däggdjur system där håret celler omges av benstrukturer i innerörat. Denna bristande tillgång har gjort det mycket svårt att förvärva funktionella invivo mätningar av hår däggdjursceller.
Protokollet beskrivs här beskriver hur du övervakar MET kanal – och presynapse-beroende förändrad kalcium inom enskilda hårcellerna och bland celler inom neuromasts i larval zebrafiskar. Detta protokoll använder tredjeparts en etablerad transgena zebrafiskar linje som uttrycker en membran-lokaliserad GCaMP6s under kontroll av de hår-cell specifika myosin6b promotorn28. Detta membran lokalisering positioner GCaMP6s för att upptäcka kalcium inflöde genom jonkanaler i plasmamembranet som är kritiska för hår-cellernas funktion. Till exempel membran-lokaliserad GCaMP6s kan upptäcka kalcium inflöde genom MET kanaler i apikala hår buntar och genom CaV1.3 kanaler nära synaptic band vid basen av cellen. Detta kontrasterar mot med GECIs lokaliserade i cytosolen, som cytosoliska GECIs upptäcka kalcium signaler som är en kombination av MET och CaV1.3 kanal aktivitet samt kalcium bidrag från andra källor (t.ex., store release). Detta protokoll beskriver hur att immobilisera och förlama GCaMP6s transgena larver före imaging. Det beskriver sedan hur du bereder och använder en vätska-jet för att avleda hår buntarna för att stimulera sidolinje hårcellerna i ett kontrollerat och reproducerbart sätt. Representativa uppgifter som kan uppnås med detta protokoll presenteras. Exempel på data som representerar rörelse artefakter presenteras också. Kontroll experiment som används för att verifiera resultaten och utesluta artefakter beskrivs. Slutligen beskrivs en metod för att visualisera rumsliga kalcium signaler i Fiji programmet. Denna Fiji-analys är anpassat från tidigare etablerade visualiseringsmetoder utvecklas med hjälp av MATLAB5. Sammantaget beskriver här protokollet en kraftfull förberedelse-teknik som använder GECIs i larval zebrafiskar att mäta och visualisera hår-cell kalcium dynamics invivo.
In vivo imaging i intakta djur är till sin natur utmanande. Flera steg i denna metod är kritiska till att erhålla tillförlitlig i vivo kalcium mätningar från sidolinje hårcellerna. Exempelvis är det mycket viktigt att larven är stiftad och förlamad ordentligt innan imaging för att minimera rörelse under imaging. Överskjutande rörelse under imaging kan leda till förändringar i GCaMP6s fluorescens som inte är sant signaler och inte motsvarar förändringar i kalciumnivåer (t.ex., siffror 4B1′-B1” och 4 C 1′-C1”). Svans pins kan placeras mer anteriorly för att minimera rörelse, även om detta kan göra mer bakre neuromasts oåtkomlig. Dessutom efter hjärtat injektion, kan chef pins roteras så att den horisontella delen av stiftet ligger över äggulan. Förutom att ändra positionen för stift, är det också möjligt att använda en hjärna-slice harpa istället för stift för att immobilisera larverna34. När den placeras över larverna ordentligt, är en harpa ytterligare, potentiellt mindre invasiva metod för att immobilisera larver. Även betydande rörelser kan resultera från otillräcklig fastlåsning, kan underlåtenhet att korrekt utföra hjärtat injektionen för att leverera α-bungarotoxin och förlama larver resultera i ofullständig förlamning, rörelse, och i slutändan rörelse artefakter. Även om vanliga bedövningsmedel har visats påverka retbarhet av zebrafisk hårcellerna, har senaste arbete visat att den anestetiska bensokain inte stör många aspekter av hår-cells aktivitet. Likaså vanligaste mer bedövningsmedel MS-222 bara stör vissa aspekter av hår-cell aktivitet15. Därför utmanande pågrund av α-bungarotoxin injektion, kan bensokain eller MS-222 program visa sig vara ett användbart alternativ metod av förlamning att förhindra rörelse i larven under funktionella kalcium imaging.
Förutom de tekniska utmaningarna som är engagerade i detta protokoll är även ett perfekt monterade prov värdelös om den larv och hårcellerna inte är hälsosam före och under varje tänkbar experiment. För att säkerställa att larver och hårcellerna är frisk, är det viktigt att larver bibehålls i E3-buffert som är fria från skräp som chorions (äggskal), avfall och mikroorganismer. Även om ytliga sidolinje hårcellerna är fördelaktiga för avbildning, detta läge gör dem mer sårbara för cellulära skador när E3 bufferten är sotigt. En ren, vattenlösning miljö är särskilt viktig för unga larver (2-4 dpf) eller mutanter som inte kan upprätthålla en upprätt simning ställning och främst ligga på botten av petriskål. I dessa situationer, sidolinje hårcellerna och skyddande cupula omger hår buntarna kan enkelt bli äventyras. Även när börjar med friska larver och hårcellerna, under varje experiment är det viktigt att säkerställa att larven har ett hjärtslag och snabb blodflödet. Om blodflödet saktar eller slutar, kan hälsa hårcellerna bli komprometterat. I komprometterad preparat som innefattar ohälsosamma larver eller förlust av blodflödet, dör hårcellerna kan identifieras på flera sätt: första att utseendet på karyopyknosis eller nukleär kondensation, vilket yttrar sig som en bubbla inom cellen under DIC optik; det andra av cell krympning och förekomsten av snabbt rörliga partiklar inom cytoplasman; och tredje, när kinocilia tips splay i olika riktningar35. När hår buntar störs, flytta de utspärrade kinocilia inte sammanhållet tillsammans vid stimulering.
Detta preparat har flera mindre begränsningar, ett är att preparatet endast förblir robust för 1-3 timmar efter det är etablerat. Ändringar, till exempel använder mindre stift eller en hjärna-slice harpa för att immobilisera larver och att lägga till en perfusion system kan förlänga livslängden på denna in-vivo -beredning. En annan begränsning är att fotoblekning och fototoxicitet kan uppstå efter upprepad imaging studier. Ett spännande sätt att övervinna denna utmaning är att anpassa detta protokoll för ljus ark mikroskopi. Ljus-ark mikroskopi är ett kraftfullt sätt att minska ur fokus ljus, vilket leder till mindre fotoblekning och fototoxicitet36. Tillsammans kan skonsammare immobilisering och mindre foto-exponering hjälpa förlänga varje bildsession. Längre imaging sessioner kan användas för att undersöka hela varaktigheten av funktionella förändringar som åtföljer utveckling och de processer som ligger bakom hår-cell clearance och förnyelse efter skada. Det är viktigt att påpeka att, förutom ljus ark mikroskopi, detta protokoll kan anpassas till andra typer confocal system (punkt-scanning, 2-photon och roterande disk) samt relativt enkla widefield system28,34 . Sammantaget gör detta protokoll ett värdefullt verktyg som kan anpassas och användas med flera bildgivande system till dess mångsidighet.
Medan detta protokoll kan anpassas och användas med många bildsystem, kan delar av detta protokoll också anpassas och användas (1) med andra indikatorer förutom GCaMP6s och (2) till avbildningen aktivitet i andra sensoriska celler och nervceller inom larval zebrafiskar. Exempelvis i en tidigare studie har använt vi detta protokoll till bilden aktivitet med flera genetiskt kodade indikatorer inom sidolinje hårcellerna för att upptäcka cytosoliska kalcium (RGECO1), vesikler fusion (SypHy), membran spänning (Bongwoori) och membran kalcium (jRCaMP1a-caax och GCaMP6s-caax), och inom sidolinje afferenta processer för att upptäcka membran kalcium (GCaMP6s-caax)5. Transgena linjen Tg(myo6b:GCaMP6s-caax) beskrivs i detta protokoll baserat på vår erfarenhet av att använda dessa indikatorer, och erbjuder en utmärkt start för imaging aktivitet i sidolinje neuromasts. Av alla de indikatorer som anges ovan, har vi funnit att GCaMP6s är den känsligaste och fotostabilt. Förutom dessa funktioner, vi belysa Tg(myo6b:GCaMP6s-caax) transgena linjen eftersom det kan användas för att göra två olika mätningar: hår-cell mechanosensation och presynaptiska calcium inom en enda transgena linje.
Den teknik som beskrivs i denna artikel visar hur kalcium imaging i zebrafiskar laterala linjen kan vara en kraftfull metod för att studera hur hårcellerna fungerar i sin ursprungliga miljö. Detta tillvägagångssätt är ett komplement till studier av däggdjur i vilken hår-cell funktion studeras för närvarande i ex vivo bladsticklingar. Zebrafisk modellen kan dessutom fortsätta att användas som en plattform för att testa effekten av genetiskt kodade indikatorer som sedan kan tillämpas för att granska aktivitet i däggdjursceller hår.
The authors have nothing to disclose.
Detta arbete stöds av NIH/NIDCD intramurala forskning medel 1ZIADC000085-01 (K.S.K.). Vi skulle vilja erkänna Candy Wong för hennes hjälp skriftligen makrot Fiji. Vi vill också tacka Doris Wu och Candy Wong för deras hjälpsamma förslag med protokollet.
Section 1 | |||
α-Bungarotoxin | R&D Systems | 2133 | For paralyzing larvae prior to imaging |
Phenol red Solution 0.5% | Sigma-Aldrich | P0290 | For visualization of α-bungarotoxin solution during heart injection |
Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate (MESAB, MS-222, tricaine) | Sigma-Aldrich | A5040 | For anesthetizing larvae |
Section 2 | |||
Imaging chamber | Siskiyou | PC-R | Platform to mount larvae for imaging |
No. 1.5 Coverslips square, 22*22 mm | VWR | 48366-227 | To seal imaging chamber |
High vacuum silicone grease | Fischer Scientific | 14-635-5D | For affixing of coverslip to imaging chamber |
Silicone encapsulant clear 0.5 g kit | Ellsworth Adhesives | Dow Corning Sylgard, 184 SIL ELAST KIT 0.5KG | To fill imaging chamber to create a surface to pin fish |
Oven | Techne | HB-1D | For drying silicone encapsulant |
Stereomicroscope | Carl Zeiss Microscopy | Stemi 2000 with transmitted light illumination | For illuminating wire, forceps and scissors to make pins |
Fine forceps | Fine Science Tools | Dumont #5 (0.05 x 0.02 mm) Item No. 11295-10 | For making pins |
Fine scissors | Cole-Palmer | 5.5", EW-10818-00 | For cutting tunsgten wire to make pins |
Tungsten wire, 0.035 mm | Goodfellow | W005131 | For head pins to immobilize larvae |
Tungsten wire, 0.025 mm | ThermoFischer Scientific | AA10405-H4 | For tail pins to immobilize larvae |
Section 3 | |||
Micropipette guller | Sutter Instrument Company | P-97 | For pulling capillary glass for fluid-jet and heart injection needles |
Borosilicate glass capillaries w/ filament | Sutter Instrument Company | BF 150-86-10 | Glass to be pulled into α-bungarotoxin injection needles for heart injection |
Borosilicate glass capillaries w/o filament | Sutter Instrument Company | B 150-86-10 | Glass to be pulled into fluid-jet needles to stimulate hair cells |
Pipette polisher | Narishige | MF-830 microforge | To polish fluid-jet pipette tips to smooth jagged breaks |
Ceramic tile | Sutter Instrument Company | NC9569052 | For scoring and evening breaking fluid-jet needles |
Sections 4 & 5 | |||
Fine forceps | Fine Science Tools | Dumont #5 (0.05 x 0.02 mm) Item No. 11295-10 | For pinning larvae |
Gel loading tips | Eppendorf | 5242956003 | For backfilling heart injection needles |
Stereomicroscope | Carl Zeiss Microscopy | Stemi 2000 with transmitted light illumination | For illuminating larvae during pinning and heart injection |
Glass capillary/needle holder | WPI | MPH315 | To hold fluid-jet needles |
Manual micromanipulator | Narishige | M-152 | For holding and positioning of needle holder to inject α-bungarotoxin |
Magnetic stand | Narishige | GJ-1 | For holding manual micromanipulator for α-bungarotoxin injection |
Pressure injector | Eppendorf | Femtojet 4x | To deliver α-bungarotoxin |
Sections 6, 7 & 8 | |||
Confocal microscope | Bruker | Swept field/Opterra confocal microscope | Fixed, upright microscope with DIC optics and 488nm laser with appropriate filters |
Microscope software | Bruker | Prairieview 5.3 | To coordinate and control the microscope, lasers, stage, piezo-z, cameras and fluid jet |
10X air objective | Nikon | MRH00101 | Low magnification for positioning of larvae and fluid jet |
60X water objective | Nikon | MRF07620 | Water immerison objective with high NA (1.0) and adequate working distance (2.0 mm) |
Piezo-Z objective scanner with controller/driver | Physik Intruments instruments/Bruker | 01144210/UM-Z-PZ | High-speed z-stack acquisition with 0.025um accuracy |
EMCCD camera | QImaging | Rolera EM-C2 EMCCD camera | Camera with small pixel size that can acquire up to 100 frames per s |
Circular chamber adapter | Siskiyou | PC-A | For holding and rotating imaging chamber on microscope stage |
Motorized Z-deck stage | Prior Scientific | ZDN12MP | Microscope stage that can hold and move sample and micromanipulator with fluid-jet needle together |
Z-deck stage insert adaptor | NIH Machine shop | custom | To fit the circular chamber adaptor onto the z-deck stage |
Fluid-jet apparatus | ALA scientific instruments | HSPC-1 High-speed pressure Clamp with PV-PUMP | For controlling and delivering the fluid-jet stimulus |
Masterflex Peroxide-cured silicone tubing (1 ft) | Cole-Palmer | Masterflex L/S 13, 96400-13 | For connecting the fluid-jet needle holder to pressure pump |
Motorized micromanipulator | Sutter Instrument Company | MP-225 | For holding and positioning of needle holder for fluid jet |
Micromanipulator controller | Sutter Instrument Company | MPC-200 | For controlling fluid-jet needle manipulator |
Gel loading tips | Eppendorf | 5242956003 | For backfilling fluid-jet needles |
Glass capillary/needle holder | WPI | MPH315 | To hold fluid-jet needles |
PSI manometer | Sper Scientific | 840081 | For measuring pressure clamp output |
Section 9 | |||
BAPTA, Tetrapotassium Salt, cell impermeant | ThermoFischer Scientific | B1204 | To cleave tips links, uncouple MET channels and block all evoked GCaMP6s signals |
Isradipine | Sigma-Aldrich | I6658 | To block signals dependent on the L-type calcium channels (CaV1.3) at the presynapse |
DMSO | Sigma-Aldrich | D8418 | Solvent for pharmacological compounds |
Section 10 | |||
Prism7 | Graphpad | Prism7 | Software to plot GCaMP6 intensity changes |
FIJI | Schindelin, et., al.34 | https://fiji.sc/ | Software to process images and create spatio-temporal signal maps |
Turboreg Plugin | Thévenaz et., al.29 | http://bigwww.epfl.ch/thevenaz/turboreg/ | Plugin to register GCaMP6 image sequences in FIJI |
StackReg Plugin | Thévenaz et., al.29 | http://bigwww.epfl.ch/thevenaz/stackreg/ | Plugin to register GCaMP6 image sequences in FIJI |
Times Series Analyzer V3 Plugin | Balaji J 2007, Dept. of Neurobiology, UCLA | https://imagej.nih.gov/ij/plugins/time-series.html | Plugin to create multiple ROIs to measure GCaMP6 intensity changes |