zebrafish एक मॉडल प्रणाली है कि ऑप्टिकल स्पष्टता, तेजी से बाह्य विकास सहित कई मूल्यवान विशेषताएं है, और, विशेष महत्व की सुनवाई और संतुलन के क्षेत्र के लिए, बाह्य संवेदी बाल कोशिकाओं स्थित है । इस लेख रूपरेखा कैसे ट्रांसजेनिक zebrafish दोनों बाल-कोशिका mechanosensation और टोटो में presynaptic समारोह परख के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है ।
संवेदी बालों की कोशिकाओं को भीतरी कान में पाया mechanoreceptors है कि सुनवाई और संतुलन के लिए आवश्यक हैं । बाल कोशिकाओं संवेदी उत्तेजनाओं कि यांत्रिक बाल बंडलों शिखर दखलंदाजी को ध्यान से हटाने के जवाब में सक्रिय कर रहे हैं । विक्षेपन mechanotransduction खोलता है (मुलाकात) बालों के बंडलों में चैनल, cations की आमद के लिए अग्रणी, कैल्शियम सहित । यह कटियन आमद कोशिका का ध्रुवीकरण और वोल्टेज-gated कैल्शियम चैनल बाल कोशिका presynapse पर बेसल स्थित खोलता है । स्तनधारियों में, बालों की कोशिकाओं को हड्डी में डिब्बे में है, और यह कार्यात्मक vivo में इन गतिविधियों का आकलन करने के लिए चुनौतीपूर्ण है । इसके विपरीत, लार्वा zebrafish पारदर्शी और एक बाह्य स्थित पार्श्व लाइन अंग है कि बालों की कोशिकाओं को शामिल अधिकारी हैं । इन बालों की कोशिकाओं को कार्यात्मक और संरचनात्मक स्तनधारी बाल कोशिकाओं के समान है और कार्यात्मक vivo में मूल्यांकन किया जा सकता है । यह लेख एक तकनीक है कि एक आनुवंशिक रूप से इनकोडिंग कैल्शियम संकेतक (GECI), GCaMP6s, उत्तेजना-zebrafish पार्श्व लाइन बाल कोशिकाओं में कैल्शियम संकेतों को मापने के लिए इस्तेमाल की रूपरेखा । GCaMP6s इस्तेमाल किया जा सकता है, फोकल इमेजिंग के साथ, vivo में उपाय करने के लिए शीर्ष और पार्श्व लाइन बाल कोशिकाओं के आधार पर कैल्शियम संकेतों । इन संकेतों को एक वास्तविक समय प्रदान करते हैं, इन बालों की कोशिकाओं के भीतर दोनों mechanosensation-और presynapse निर्भर कैल्शियम की गतिविधियों की quantifiable readout । इन कैल्शियम संकेतों को भी महत्वपूर्ण कार्यात्मक कैसे बाल कोशिकाओं का पता लगाने और संवेदी उत्तेजनाओं संचारित के बारे में जानकारी प्रदान करते हैं । कुल मिलाकर, इस तकनीक vivo में कैल्शियम गतिविधि में रिश्तेदार परिवर्तन के बारे में उपयोगी डेटा उत्पंन करता है । यह कम अच्छी तरह से कैल्शियम परिवर्तन के निरपेक्ष परिमाण के ठहराव के लिए अनुकूल है । vivo तकनीक में यह गति कलाकृतियों के प्रति संवेदनशील है । उचित स्थिति, स्थिरीकरण और लार्वा की उत्तेजना के लिए उचित मात्रा में अभ्यास और कौशल की आवश्यकता होती है । अंततः, जब ठीक से मार डाला, इस लेख में उल्लिखित प्रोटोकॉल एक शक्तिशाली तरीका अपने प्राकृतिक में बाल कोशिकाओं की गतिविधि के बारे में बहुमूल्य जानकारी एकत्र प्रदान करता है, एक जीवित जानवर के भीतर पूरी तरह से एकीकृत राज्यों ।
कार्यात्मक कैल्शियम इमेजिंग एक शक्तिशाली उपकरण है कि एक साथ कई कोशिकाओं की गतिविधि पर नजर रखने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है1. विशेष रूप से, कैल्शियम इमेजिंग आनुवंशिक रूप से इनकोडिंग कैल्शियम संकेतक (GECIs) का उपयोग करने के लिए लाभप्रद होना दिखाया गया है क्योंकि GECIs विशिष्ट कोशिका प्रकार में व्यक्त किया जा सकता है और स्थानीय सेलुलर2। तंत्रिका विज्ञान अनुसंधान में, इन सुविधाओं कैल्शियम इमेजिंग बना दिया है GECIs एक शक्तिशाली विधि का उपयोग कर दोनों को परिभाषित करने के लिए ंयूरॉन नेटवर्क के भीतर गतिविधि पैटर्न और मापने के व्यक्तिगत synapses3,4पर कैल्शियम की आमद । इन सुविधाओं का लाभ उठाते हुए, एक ताजा अध्ययन फोकल माइक्रोस्कोपी और GECIs संवेदी बाल कोशिकाओं के संग्रह के भीतर उपसेलुलर गतिविधि की निगरानी करने के लिए इस्तेमाल किया5.
बाल कोशिकाओं mechanoreceptors कि भीतरी कान और जलीय vetebrates6,7में पार्श्व लाइन प्रणाली में स्थानीय पानी के आंदोलन में ध्वनि और vestibular उत्तेजनाओं का पता लगाने हैं । बाल कोशिकाओं को अक्सर नुकसान या आनुवंशिक उत्परिवर्तनों का लक्ष्य है कि sensorineural सुनवाई8,9के रूप में जाना जाता मनुष्यों में सुनवाई हानि का सबसे आम रूप में परिणाम कर रहे हैं । इसलिए, यह समझने के लिए महत्वपूर्ण है कि इन कोशिकाओं को कैसे इलाज और सुनवाई हानि को रोकने के क्रम में काम करते हैं । ठीक से कार्य करने के लिए, बाल कोशिकाओं mechanosensory नामक दो विशेष संरचनाओं का उपयोग-बाल बंडलों और synaptic रिबन का पता लगाने और उत्तेजनाओं संचारित, क्रमशः । बाल बंडलों बाल कोशिकाओं के शीर्ष पर स्थित है और कर रहे है मुख्य रूप से ठीक है, बाल stereocilia के रूप में जाना जाता है (चित्रा 1A) के रूप में दखलंदाजी की तरह । vestibular और पार्श्व लाइन बाल कोशिकाओं में, प्रत्येक बाल बंडल भी एक लंबी kinocilium है (है सेल केवल सच पपनी), जो अभी तक stereocilia (चित्रा 1a) से ऊपर का विस्तार कर सकते हैं । Mechanosensory उत्तेजनाओं बालों के बंडलों से ध्यान हटाने, और झुकाव “टिप-लिंक” कहा जाता है कि10stereocilia आपस में संपर्क पर तनाव डालता है । यह तनाव stereocilia में स्थित mechanotransduction (MET) चैनल खोलता है, जिसके परिणामस्वरूप cations की एक शिखर आमद हुई, जिसमें कैल्शियम11,12शामिल है । इस शिखर गतिविधि अंततः बाल कोशिका ध्रुवीकरण और कोशिका के आधार पर वोल्टेज-gated कैल्शियम चैनल (सीएv१.३) खोलता है. Cav१.३ चैनल synaptic रिबन, एक presynaptic संरचना है कि सक्रिय क्षेत्रों में बुलबुले tethers के आसंन पाया जाता है । सीएv१.३ चैनलों के माध्यम से बेसल कैल्शियम की आमद पुटिका फ्यूजन, neurotransmission, और afferent ंयूरॉंस13,14के सक्रियकरण के लिए आवश्यक है ।
कई वर्षों के लिए, electrophysiological तकनीक जैसे पूरे सेल पैच clamping zebrafish15,16,17 सहित कई प्रजातियों में बाल कोशिकाओं के कार्यात्मक गुणों की जांच करने के लिए इस्तेमाल किया गया है, 18,19,20. इन electrophysiological रिकॉर्डिंग सुनवाई और शेष क्षेत्रों में विशेष रूप से मूल्यवान है क्योंकि वे व्यक्तिगत संवेदी कोशिकाओं से अत्यंत संवेदनशील माप प्राप्त करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, जिसका उद्देश्य एक पर अत्यंत तेज उत्तेजनाओं सांकेतिक शब्दों में बदलना है आवृत्तियों और तीव्रता21,22की वाइड रेंज । दुर्भाग्य से, पूरे सेल रिकॉर्डिंग बाल कोशिकाओं की आबादी की गतिविधि को मापने नहीं कर सकते । zebrafish पार्श्व लाइन में कोशिकाओं की आबादी की गतिविधि का अध्ययन करने के लिए, microphonic क्षमता और afferent कार्रवाई संभावितों के लिए संक्षेप mechanosensitive और postsynaptic प्रतिक्रिया गुणों को मापने के लिए इस्तेमाल किया गया है व्यक्तिगत neuromasts23 ,24. दुर्भाग्य से, न तो पूरे सेल रिकॉर्डिंग और न ही स्थानीय क्षेत्र संभावित माप स्थानिक संकल्प को तुच्छ जहां गतिविधि व्यक्तिगत कोशिकाओं के भीतर हो रही है या एक जनसंख्या के भीतर प्रत्येक कोशिका की गतिविधि को मापने के लिए है । हाल ही में, कैल्शियम रंजक और GECIs इन चुनौतियों बाईपास करने के लिए नियोजित किया गया है25,26.
zebrafish में, GECIs बाल कोशिका ट्रांसजेनिक zebrafish और27लार्वा की ऑप्टिकल स्पष्टता बनाने के रिश्तेदार आसानी के कारण समारोह की जांच करने के लिए एक शक्तिशाली दृष्टिकोण साबित किया है । zebrafish लार्वा में बाल कोशिकाएँ भीतरी कान के साथ-साथ पार्श्व-रेखा प्रणाली में विद्यमान होती हैं. पार्श्व रेखा से बना है rosette बाल कोशिकाओं के समूहों की तरह neuromasts कहा जाता है कि जल आंदोलन में स्थानीय परिवर्तन का पता लगाने के लिए उपयोग किया जाता है (चित्रा 1) । पार्श्व पंक्ति विशेष रूप से उपयोगी है क्योंकि यह बाहरी रूप से मछली की सतह के साथ स्थित है । यह पहुँच बाल कोशिकाओं को उत्तेजित करने के लिए संभव बना दिया है और कैल्शियम संकेतों बरकरार लार्वा में ऑप्टिकली उपाय. कुल मिलाकर, transgenesis की आसानी, लार्वा की पारदर्शिता, और पार्श्व लाइन बाल कोशिकाओं के अद्वितीय उपयोग zebrafish एक अमूल्य मॉडल को vivo में बाल कोशिकाओं की गतिविधि का अध्ययन किया है । स्तनधारी सिस्टम की तुलना में यह एक महत्वपूर्ण लाभ है जिसमें बालों की कोशिकाएं भीतरी कान की बोनी संरचनाओं से घिरी होती हैं । प्रवेश के इस कमी यह बहुत स्तनधारी बाल कोशिकाओं के vivo माप में कार्यात्मक प्राप्त मुश्किल बना दिया है ।
यहां उल्लिखित प्रोटोकॉल का वर्णन करता है कि कैसे मुलाकात की निगरानी करने के लिए चैनल-और presynapse-निर्भर में कैल्शियम में परिवर्तन व्यक्तिगत बाल कोशिकाओं के भीतर और कोशिकाओं के बीच में neuromasts भीतर लार्वा zebrafish. यह प्रोटोकॉल एक स्थापित ट्रांसजेनिक zebrafish लाइन है कि बाल कोशिका विशिष्ट myosin6b प्रवर्तक28के नियंत्रण में एक झिल्ली-स्थानीयकृत GCaMP6s व्यक्त करता है का इस्तेमाल । इस झिल्ली स्थानीयकरण स्थिति बाल कोशिका समारोह के लिए महत्वपूर्ण हैं कि प्लाज्मा झिल्ली में स्थित आयन चैनलों के माध्यम से कैल्शियम की आमद का पता लगाने के लिए GCaMP6s. उदाहरण के लिए, झिल्ली-स्थानीयकृत GCaMP6s शिखर बालों के बंडलों में मिले चैनलों के माध्यम से और सेल के आधार पर synaptic रिबन के पास सीएV१.३ चैनलों के माध्यम से कैल्शियम की आमद का पता लगा सकते हैं । इस cytosol में स्थानीयकृत GECIs का उपयोग कर के साथ विरोधाभासों, के रूप में cytosolic GECIs कैल्शियम संकेतों का पता लगाने कि मिले और CaV१.३ चैनल गतिविधि के साथ ही अन्य स्रोतों से कैल्शियम का योगदान का एक संयोजन कर रहे हैं (जैसे, स्टोर रिलीज). यह प्रोटोकॉल कैसे स्थिर और पंगु बना GCaMP6s ट्रांसजेनिक लार्वा इमेजिंग करने से पहले रूपरेखा । यह तो एक नियंत्रित और reproducible तरीके से पार्श्व लाइन बाल कोशिकाओं को उत्तेजित करने के लिए बाल बंडलों को ध्यान में रखना कैसे तैयार करने और एक द्रव जेट का उपयोग करने के लिए वर्णन करता है । प्रतिनिधि डेटा है कि इस प्रोटोकॉल का उपयोग कर प्राप्त किया जा सकता प्रस्तुत कर रहे हैं । आंदोलन कलाकृतियों का प्रतिनिधित्व करने वाले डेटा के उदाहरण भी प्रस्तुत किए गए हैं । परिणाम सत्यापित करने और कलाकृतियां बहिष्कृत करने के लिए उपयोग किए जाने वाले नियंत्रण प्रयोग बताए गए हैं । अंत में, एक विधि फिजी सॉफ्टवेयर में स्थानिक कैल्शियम संकेतों कल्पना करने के लिए वर्णित है । इस फिजी विश्लेषण पहले से स्थापित दृश्य MATLAB5का उपयोग कर विकसित तरीकों से अनुकूलित है । कुल मिलाकर, इस प्रोटोकॉल एक शक्तिशाली तैयारी तकनीक है कि लार्वा zebrafish में GECIs का उपयोग करता है को मापने और vivo में बाल कोशिका कैल्शियम गतिशीलता कल्पना रूपरेखा ।
बरकरार जानवरों में vivo इमेजिंग में स्वाभाविक चुनौतीपूर्ण है । इस विधि में कई कदम पार्श्व लाइन बाल कोशिकाओं से vivo कैल्शियम माप में विश्वसनीय प्राप्त करने के लिए महत्वपूर्ण हैं । उदाहरण के लिए, यह लार्वा इमेजिंग के दौरान आंदोलन को कम करने के लिए इमेजिंग से पहले पिन किए गए और ठीक से रुक गया है कि बहुत महत्वपूर्ण है । इमेजिंग के दौरान अतिरिक्त आंदोलन GCaMP6s प्रतिदीप्ति में परिवर्तन करने के लिए नेतृत्व कर सकते हैं कि सही संकेत नहीं हैं और कैल्शियम के स्तर में परिवर्तन के अनुरूप नहीं है (जैसे, आंकड़े 4B1′-B1 ‘ ‘ और 4C1′-c1 ‘ ‘). पूंछ पिन अधिक पूर्वकाल में रखा जा सकता है मदद करने के लिए आंदोलन को कम करने, हालांकि यह अधिक पीछे neuromasts दुर्गम प्रदान कर सकते हैं । इसके अलावा, दिल इंजेक्शन के बाद, सिर पिन इतना घुमाया जा सकता है कि पिन के क्षैतिज हिस्से की जर्दी में निहित है । पिन की स्थिति को बदलने के अलावा, यह भी एक मस्तिष्क टुकड़ा वीणा का उपयोग करने के लिए पिन के बजाय लार्वा स्थिर करने के लिए संभव है३४. जब लार्वा को ठीक से रखा जाता है, तो एक वीणा लार्वा को स्थिर करने का एक अतिरिक्त, संभावित रूप से कम इनवेसिव तरीका है । हालांकि महत्वपूर्ण आंदोलन अपर्याप्त लगाए से परिणाम कर सकते हैं, ठीक से दिल इंजेक्शन प्रदर्शन करने के लिए α-bungarotoxin और पंगु बना लार्वा अपूर्ण पक्षाघात, आंदोलन में परिणाम कर सकते हैं, और अंत में गति कलाकृतियों प्रदान करने के लिए विफलता । हालांकि आमतौर पर इस्तेमाल किया निश्चेतक को zebrafish बाल कोशिकाओं की उत्तेजितता को प्रभावित दिखाया गया है, हाल ही में काम पता चला है कि संवेदनाहारी benzocaine बाल सेल गतिविधि के कई पहलुओं के साथ हस्तक्षेप नहीं करता है । इसी तरह, अधिक सामांयतः इस्तेमाल किया संवेदनाहारी MS-२२२ केवल बाल सेल गतिविधि के कुछ पहलुओं के साथ हस्तक्षेप15। इसलिए, α-bungarotoxin इंजेक्शन के चुनौतीपूर्ण प्रकृति के कारण, benzocaine या एमएस-२२२ आवेदन कार्यात्मक कैल्शियम इमेजिंग के दौरान लार्वा में आंदोलन को रोकने के लिए पक्षाघात की एक उपयोगी वैकल्पिक पद्धति साबित हो सकता है ।
इस प्रोटोकॉल में शामिल तकनीकी चुनौतियों के अलावा, यहां तक कि एक पूरी तरह से घुड़सवार नमूना बेकार है अगर लार्वा और बाल कोशिकाओं से पहले और प्रत्येक इमेजिंग प्रयोग के दौरान स्वस्थ नहीं हैं । यह सुनिश्चित करने के लिए कि लार्वा और बाल कोशिकाएं स्वस्थ हैं, यह महत्वपूर्ण है कि लार्वा E3 बफ़र में बनाए रखे जाते हैं जो इस तरह की चोरियों (अंडे के गोले), अपशिष्ट और सूक्ष्मजीवों जैसे मलबे से मुक्त होते हैं । हालांकि पार्श्व लाइन बाल कोशिकाओं के सतही स्थान इमेजिंग के लिए लाभप्रद है, यह स्थान बनाता है उंहें और अधिक असुरक्षित सेलुलर नुकसान के लिए जब E3 बफर है बेईमान । एक स्वच्छ, जलीय वातावरण युवा लार्वा (2-4 dpf) या म्यूटेंट है कि एक ईमानदार तैराकी की स्थिति बनाए रखने और मुख्य रूप से पेट्री पकवान के तल पर झूठ नहीं कर सकते के लिए विशेष रूप से महत्वपूर्ण है । इन स्थितियों में, पार्श्व लाइन बाल कोशिकाओं और सुरक्षात्मक बाल बंडलों आसपास cupula आसानी से समझौता हो सकता है । यहां तक कि जब स्वस्थ लार्वा और बाल कोशिकाओं के साथ शुरू, प्रत्येक प्रयोग के दौरान, यह यह सुनिश्चित करने के लिए महत्वपूर्ण है कि लार्वा दिल की धड़कन और तेजी से रक्त का प्रवाह है । यदि रक्त का प्रवाह धीमा या बंद हो जाता है तो बाल कोशिकाओं के स्वास्थ्य में समझौता बन सकता है. अस्वास्थ्यकर लार्वा या रक्त प्रवाह की हानि शामिल समझौता तैयारियों में, मरने बाल कोशिकाओं कई मायनों में पहचान की जा सकती है: पहले, karyopyknosis या परमाणु संघनित्र, जो सेल के भीतर एक बुलबुला के रूप में प्रकट होता है की उपस्थिति से के तहत उद्योग प्रकाशिकी; दूसरा, कोशिका संकोचन और कोशिका द्रव्य के भीतर तेजी से चलती कणों की उपस्थिति के द्वारा; और तीसरा, जब kinocilia युक्तियां अलग३५दिशाओं में बाहर splay । जब बाल बंडलों को बाधित कर रहे हैं, splayed kinocilia उत्तेजना के दौरान एक साथ cohesively कदम नहीं है ।
यह तैयारी कई छोटी सीमाएं हैं, एक जा रहा है कि तैयारी केवल 1-3 घंटे के लिए मजबूत है के बाद यह स्थापित है । लार्वा को स्थिर करने और छिड़काव सिस्टम जोड़ने के लिए छोटे पिन या ब्रेन-स्लाइस वीणा का उपयोग करने जैसे संशोधन vivo तैयारी में इस के जीवनकाल का विस्तार कर सकते हैं । एक और सीमा है कि photobleaching और phototoxicity दोहराया इमेजिंग परीक्षणों के बाद हो सकता है । एक रोमांचक तरीका इस चुनौती को दूर करने के लिए प्रकाश शीट माइक्रोस्कोपी के लिए इस प्रोटोकॉल अनुकूलन है । लाइट शीट माइक्रोस्कोपी फोकस प्रकाश से कम करने के लिए एक शक्तिशाली तरीका है, कम photobleaching और phototoxicity३६करने के लिए अग्रणी. एक साथ, gentler स्थिरीकरण और कम फोटो प्रदर्शन प्रत्येक इमेजिंग सत्र को लम्बा करने में मदद कर सकते हैं । अब इमेजिंग सत्र के लिए कार्यात्मक विकास के साथ परिवर्तन की पूरी अवधि की जांच और बाल-कोशिका निकासी और चोट के बाद पुनर्जनन अंतर्निहित प्रक्रियाओं का इस्तेमाल किया जा सकता है । यह बात करने के लिए महत्वपूर्ण है कि, प्रकाश शीट माइक्रोस्कोपी के अलावा, इस प्रोटोकॉल अंय प्रकार के लिए अनुकूलित किया जा सकता है फोकल सिस्टम (बिंदु स्कैनिंग, 2-फोटॉन, और डिस्क कताई) के रूप में के रूप में अच्छी तरह से अपेक्षाकृत सरल widefield सिस्टम28,३४ . कुल मिलाकर, अपनी बहुमुखी प्रतिभा इस प्रोटोकॉल एक महत्वपूर्ण उपकरण है कि अनुकूलित किया जा सकता है और कई इमेजिंग प्रणालियों के साथ प्रयोग करता है ।
हालांकि इस प्रोटोकॉल और अनुकूलित किया जा सकता है कई इमेजिंग प्रणालियों के साथ प्रयोग किया जाता है, इस प्रोटोकॉल के कुछ हिस्सों को भी अनुकूलित किया जा सकता है और (1) GCaMP6s के अलावा अंय संकेतकों और (2) के साथ अंय संवेदी कोशिकाओं और ंयूरॉंस में छवि गतिविधि के लिए लार्वा zebrafish के भीतर । उदाहरण के लिए, पिछले एक अध्ययन में, हम cytosolic कैल्शियम (RGECO1), पुटिका फ्यूजन (SypHy), झिल्ली वोल्टेज (Bongwoori), और झिल्ली का पता लगाने के लिए पार्श्व लाइन बाल कोशिकाओं के भीतर कई आनुवंशिक रूप से इनकोडिंग संकेतकों का उपयोग कर छवि गतिविधि के लिए इस प्रोटोकॉल का इस्तेमाल किया कैल्शियम (jRCaMP1a-caax और GCaMP6s-caax), और पार्श्व के भीतर लाइन afferent झिल्ली कैल्शियम का पता लगाने के लिए प्रक्रियाओं (GCaMP6s-caax)5. इन संकेतकों का उपयोग कर हमारे अनुभव के आधार पर, ट्रांसजेनिक लाइन टीजी (myo6b: GCaMP6s-caax) इस प्रोटोकॉल में वर्णित पार्श्व लाइन neuromasts में इमेजिंग गतिविधि के लिए एक उत्कृष्ट शुरू प्रदान करता है । ऊपर सूचीबद्ध सभी संकेतकों में से हमने पाया है कि GCaMP6s सबसे संवेदनशील और photostable है । इन सुविधाओं के अलावा, हम टीजी (myo6b: GCaMP6s-caax) ट्रांसजेनिक लाइन पर प्रकाश डाला क्योंकि यह दो अलग माप बनाने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है: एक एकल mechanosensation लाइन के भीतर बाल कोशिका presynaptic और ट्रांसजेनिक कैल्शियम.
इस आलेख में उल्लिखित तकनीक प्रदर्शित करता है कि कैसे zebrafish पार्श्व पंक्ति में कैल्शियम इमेजिंग एक शक्तिशाली विधि कैसे अपने पैतृक वातावरण में बाल कोशिकाओं समारोह का अध्ययन करने के लिए किया जा सकता है । यह दृष्टिकोण स्तनधारियों के अध्ययन के पूरक है जिसमें हेयर-सेल का कार्य वर्तमान में पूर्व वीवो explants में अध्ययन किया जा रहा है । इसके अलावा, zebrafish मॉडल के लिए एक मंच के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है आनुवंशिक रूप से इनकोडिंग संकेतक है कि फिर स्तनधारी बाल कोशिकाओं में गतिविधि की जांच लागू किया जा सकता है की प्रभावकारिता का परीक्षण ।
The authors have nothing to disclose.
इस कार्य को NIH/NIDCD अंदर रिसर्च फंड्स 1ZIADC000085-01 (K.S.K.) ने सपोर्ट किया था । हम फिजी स्थूल लेखन में उसकी सहायता के लिए कैंडी वोंग स्वीकार करना चाहते हैं । हम भी अपने प्रोटोकॉल के साथ उपयोगी सुझावों के लिए डोरिस वू और कैंडी वोंग शुक्रिया अदा करना चाहूंगा ।
Section 1 | |||
α-Bungarotoxin | R&D Systems | 2133 | For paralyzing larvae prior to imaging |
Phenol red Solution 0.5% | Sigma-Aldrich | P0290 | For visualization of α-bungarotoxin solution during heart injection |
Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate (MESAB, MS-222, tricaine) | Sigma-Aldrich | A5040 | For anesthetizing larvae |
Section 2 | |||
Imaging chamber | Siskiyou | PC-R | Platform to mount larvae for imaging |
No. 1.5 Coverslips square, 22*22 mm | VWR | 48366-227 | To seal imaging chamber |
High vacuum silicone grease | Fischer Scientific | 14-635-5D | For affixing of coverslip to imaging chamber |
Silicone encapsulant clear 0.5 g kit | Ellsworth Adhesives | Dow Corning Sylgard, 184 SIL ELAST KIT 0.5KG | To fill imaging chamber to create a surface to pin fish |
Oven | Techne | HB-1D | For drying silicone encapsulant |
Stereomicroscope | Carl Zeiss Microscopy | Stemi 2000 with transmitted light illumination | For illuminating wire, forceps and scissors to make pins |
Fine forceps | Fine Science Tools | Dumont #5 (0.05 x 0.02 mm) Item No. 11295-10 | For making pins |
Fine scissors | Cole-Palmer | 5.5", EW-10818-00 | For cutting tunsgten wire to make pins |
Tungsten wire, 0.035 mm | Goodfellow | W005131 | For head pins to immobilize larvae |
Tungsten wire, 0.025 mm | ThermoFischer Scientific | AA10405-H4 | For tail pins to immobilize larvae |
Section 3 | |||
Micropipette guller | Sutter Instrument Company | P-97 | For pulling capillary glass for fluid-jet and heart injection needles |
Borosilicate glass capillaries w/ filament | Sutter Instrument Company | BF 150-86-10 | Glass to be pulled into α-bungarotoxin injection needles for heart injection |
Borosilicate glass capillaries w/o filament | Sutter Instrument Company | B 150-86-10 | Glass to be pulled into fluid-jet needles to stimulate hair cells |
Pipette polisher | Narishige | MF-830 microforge | To polish fluid-jet pipette tips to smooth jagged breaks |
Ceramic tile | Sutter Instrument Company | NC9569052 | For scoring and evening breaking fluid-jet needles |
Sections 4 & 5 | |||
Fine forceps | Fine Science Tools | Dumont #5 (0.05 x 0.02 mm) Item No. 11295-10 | For pinning larvae |
Gel loading tips | Eppendorf | 5242956003 | For backfilling heart injection needles |
Stereomicroscope | Carl Zeiss Microscopy | Stemi 2000 with transmitted light illumination | For illuminating larvae during pinning and heart injection |
Glass capillary/needle holder | WPI | MPH315 | To hold fluid-jet needles |
Manual micromanipulator | Narishige | M-152 | For holding and positioning of needle holder to inject α-bungarotoxin |
Magnetic stand | Narishige | GJ-1 | For holding manual micromanipulator for α-bungarotoxin injection |
Pressure injector | Eppendorf | Femtojet 4x | To deliver α-bungarotoxin |
Sections 6, 7 & 8 | |||
Confocal microscope | Bruker | Swept field/Opterra confocal microscope | Fixed, upright microscope with DIC optics and 488nm laser with appropriate filters |
Microscope software | Bruker | Prairieview 5.3 | To coordinate and control the microscope, lasers, stage, piezo-z, cameras and fluid jet |
10X air objective | Nikon | MRH00101 | Low magnification for positioning of larvae and fluid jet |
60X water objective | Nikon | MRF07620 | Water immerison objective with high NA (1.0) and adequate working distance (2.0 mm) |
Piezo-Z objective scanner with controller/driver | Physik Intruments instruments/Bruker | 01144210/UM-Z-PZ | High-speed z-stack acquisition with 0.025um accuracy |
EMCCD camera | QImaging | Rolera EM-C2 EMCCD camera | Camera with small pixel size that can acquire up to 100 frames per s |
Circular chamber adapter | Siskiyou | PC-A | For holding and rotating imaging chamber on microscope stage |
Motorized Z-deck stage | Prior Scientific | ZDN12MP | Microscope stage that can hold and move sample and micromanipulator with fluid-jet needle together |
Z-deck stage insert adaptor | NIH Machine shop | custom | To fit the circular chamber adaptor onto the z-deck stage |
Fluid-jet apparatus | ALA scientific instruments | HSPC-1 High-speed pressure Clamp with PV-PUMP | For controlling and delivering the fluid-jet stimulus |
Masterflex Peroxide-cured silicone tubing (1 ft) | Cole-Palmer | Masterflex L/S 13, 96400-13 | For connecting the fluid-jet needle holder to pressure pump |
Motorized micromanipulator | Sutter Instrument Company | MP-225 | For holding and positioning of needle holder for fluid jet |
Micromanipulator controller | Sutter Instrument Company | MPC-200 | For controlling fluid-jet needle manipulator |
Gel loading tips | Eppendorf | 5242956003 | For backfilling fluid-jet needles |
Glass capillary/needle holder | WPI | MPH315 | To hold fluid-jet needles |
PSI manometer | Sper Scientific | 840081 | For measuring pressure clamp output |
Section 9 | |||
BAPTA, Tetrapotassium Salt, cell impermeant | ThermoFischer Scientific | B1204 | To cleave tips links, uncouple MET channels and block all evoked GCaMP6s signals |
Isradipine | Sigma-Aldrich | I6658 | To block signals dependent on the L-type calcium channels (CaV1.3) at the presynapse |
DMSO | Sigma-Aldrich | D8418 | Solvent for pharmacological compounds |
Section 10 | |||
Prism7 | Graphpad | Prism7 | Software to plot GCaMP6 intensity changes |
FIJI | Schindelin, et., al.34 | https://fiji.sc/ | Software to process images and create spatio-temporal signal maps |
Turboreg Plugin | Thévenaz et., al.29 | http://bigwww.epfl.ch/thevenaz/turboreg/ | Plugin to register GCaMP6 image sequences in FIJI |
StackReg Plugin | Thévenaz et., al.29 | http://bigwww.epfl.ch/thevenaz/stackreg/ | Plugin to register GCaMP6 image sequences in FIJI |
Times Series Analyzer V3 Plugin | Balaji J 2007, Dept. of Neurobiology, UCLA | https://imagej.nih.gov/ij/plugins/time-series.html | Plugin to create multiple ROIs to measure GCaMP6 intensity changes |