Diagnostic de la maladie de Hirschspiral par immunostaining des biopsies d’aspiration rectale pour la Calrétinine, le gène protéine et le produit de protéine 9,5
Summary
Ce protocole décrit le processus d’immunocoloration des biopsies d’aspiration rectale pour la calrétinine, la protéine de 9,5 et le produit du gène protéique. Cette nouvelle méthode de diagnostic adjuvant pour la maladie de Hirschspiral a des taux de sensibilité et de spécificité préférables.
Abstract
La maladie de hirschspiral (MH) est une maladie intestinale congénitale qui est cliniquement manifestée comme une incapacité à passer le méconium chez les nourrissons ou en tant que constipation à long terme chez les enfants. La biopsie d’aspiration rectale (RSB) pour déterminer l’absence de cellules ganglionnaires et l’hypertrophie neuronale est le test le plus précis pour le diagnostic de la MH à l’heure actuelle. La coloration traditionnelle de l’hématoxyline-éosine manque de sensibilité et de spécificité. La coloration de l’acétylcholinestérase ne peut pas être largement utilisée en raison de son processus complexe. Notre protocole novateur d’immunocoloration pour la calrétinine, la protéine et le produit du gène protéine 9,5 (PGP 9.5), que nous avons réalisé sur les rsbs, présente des taux de sensibilité et de spécificité élevés de 96,49% (intervalle de confiance de 95%, 0,88-0,99) et 100% (confiance de 95% de l’intervalle, 0,97-1,00), respectivement. Les segments touchés par la MH sont souvent présents comme l’absence de l’expression de la calrétinine, de la protéine et du PGP 9.5, qui sont des marqueurs de l’hypertrophie neurale dans le tissu sous-muqueuse. Ce protocole décrit le processus d’exploitation détaillé de cette nouvelle méthode de diagnostic.
Introduction
La maladie de hirschspiral (MH) est une affection intestinale congénitale commune caractérisée par un manque de cellules ganglionnaires dans différents segments du tractus intestinal distal1. Le système nerveux entérique humain est formé lorsque l’invasion des cellules neuronales embryonnaires est achevée. S’il y a une perturbation du processus et que l’invasion ne parvient pas à se terminer, l’intestin distal du nouveau-né devient aganglionique2. Cette condition potentiellement fatale est appelée la maladie de Hirschspiral. La prolifération, la motilité et la croissance intestinale sont les trois composantes principales de la colonisation réussie.
La coloration traditionnelle de l’hématoxyline et de l’éosine (H & E) d’une biopsie submuqueuse limitée ne peut pas atteindre un résultat aussi satisfaisant que la coloration H & E d’un tissu d’épaisseur totale obtenu par chirurgie. En outre, la coloration de l’acétylcholinestérase (AChE) du tissu d’aspiration rectal est théoriquement difficile en raison de sa sensibilité inadéquate, qui est de 91%, et le traitement complexe des sections3,4congelées. Plusieurs autres marqueurs immunohistochimiques des cellules ganglionnaires et des fibres nerveuses qui peuvent être souillés dans des spécimens fixes et paraffines sont progressivement devenus les principaux diagnostics HD. La calrétinine est une protéine liant le calcium dépendante de la vitamine D qui n’est pas exprimée dans le plexus myentérique et sous-muqueuse des segments atteints de MH5. La protéine est exprimée dans les cellules dérivées de la crête neurale, comme les fibres nerveuses et les cellules gliales, qui présentent souvent une hypertrophie neuronale dans le tissu sous-muqueuse des segments atteints de MH6. Le produit du gène protéique 9,5 (PGP 9.5) colore de manière fiable les fibres nerveuses et les cellules ganglionnaires; La coloration PGP 9.5 agit comme un complément à la coloration de la calrétinine, en particulier dans les cas d’hypogangliose isolée. Une double coloration avec les résultats de 2, 9 et 9 peut diminuer le taux de faux-négatif et augmenter la sensibilité. Comme condition préalable, l’étude actuelle vise à assurer une spécificité et une sensibilité suffisantes de cette nouvelle méthode diagnostique. Notre protocole de roman a utilisé les trois marqueurs pour la discrimination de l’intestin aganglionique et des fibres nerveuses hypertrophiques. Une étude prospective de 318 enfants a été réalisée par notre laboratoire et publiée antérieurement sans protocole détaillé7. Le protocole détaillé et les précautions sont discutés dans cet article. Tous les nouveau-nés qui ont souffert d’un problème de défécation sévère depuis la naissance ou les enfants souffrant de constipation chronique excluant d’autres maladies courantes sont des candidats potentiels pour la biopsie d’aspiration rectale (RSB). Notre protocole novateur est adapté pour la coloration non seulement des RSBs mais aussi des biopsies d’épaisseur complète ou des spécimens chirurgicaux pour faire un diagnostic final.
Protocol
Representative Results
Discussion
Nous avons décrit ici une procédure utilisant trois anticorps immunohistochimiques différents pour colorer les sections RBS pour le diagnostic de la MH. La sensibilité de notre protocole diagnostique était de 96,49% (95% IC, 0,88-0,99), et la spécificité était de 100% (95% IC, 0,97-1,00).
Les étapes les plus critiques du protocole sont le RSB et la réaction antigène-anticorps. La taille de la biopsie détermine la précision de la coloration. Une petite biopsie ne fournira pas assez…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Les auteurs remercient Weibing Tang pour sa grande aide dans la fourniture du laboratoire de tournage. Cet article est appuyé par la recherche sur le bien-être public, et des fonds spéciaux ont été reçus de la santé nationale et de la planification familiale de la Chine (Grant No. 201402007).
Materials
| calretinin antibody | MXB Biotechnologies | MAB-0716 170416405c | antibody: primary antibody |
| S-100 antibody | MXB Biotechnologies | Kit-0007 | antibody: primary antibody |
| PGP9.5 antibody | Shanghai long island antibody Co. Ltd | R-0457-03 | antibody: primary antibody |
| enhancer reagent | MXB Biotechnologies | KIT-9902-A 170416405a | antibody: secondary antibody A |
| Goat anti-Rabbit/Mouse IgG Secondary Antibody | MXB Biotechnologies | KIT-9902-B | antibody: secondary antibody B |
| DAB staining kit (containing reagent A B and C) | MXB Biotechnologies | DAB-0031 | staining kit |
| Heat incubator | Shanghai yiheng instrument Co. Ltd | DHP-9082 | instrument |
| Rbi2 suction rectal biopsy system | Aus Systems Pty Ltd, South Australia, Australia | CP1200 HP1000 SS1000 | instrument |
| microtome | Leica | leica RM2016 | instrument |
| citric acid sodium citrate buffer(100X) | MXB Biotechnologies | MVS-0101 | antigen retrieval buffer |
| pathological tissue dehydrator | wuhan junjie electronic Co. Ltd | JT-12F | instrument |
Riferimenti
- Tam, P. K. Hirschsprung’s disease: A bridge for science and surgery. Journal of Pediatric Surgery. 51 (1), 18-22 (2016).
- Heanue, T. A., Pachnis, V. Enteric nervous system development and Hirschsprung’s disease: advances in genetic and stem cell studies. Nature Reviews Neuroscience. 8 (6), 466-479 (2007).
- Setiadi, J. A., Dwihantoro, A., Iskandar, K., Heriyanto, D. S., Gunadi, The utility of the hematoxylin and eosin staining in patients with suspected Hirschsprung disease. BMC Surgery. 17 (1), 71 (2017).
- Agrawal, R. K., et al. Acetylcholinesterase histochemistry (AChE) – A helpful technique in the diagnosis and in aiding the operative procedures of Hirschsprung disease. Diagnostic Pathology. 10 (1), 208 (2015).
- Kacar, A., Arikok, A. T., Azili, M. N., Ekberli Agirbas, G., Tiryaki, T. Calretinin immunohistochemistry in Hirschsprung’s disease: An adjunct to formalin-based diagnosis. The Turkish Journal of Gastroenterology. 23 (3), 226-233 (2012).
- Bachmann, L., et al. Immunohistochemical panel for the diagnosis of Hirschsprung's disease using antibodies to MAP2, calretinin, GLUT1 and S100. Histopathology. 66 (6), 824-835 (2015).
- Jiang, M., et al. S100 and protein gene product 9.5 immunostaining of rectal suction biopsies in the diagnosis of Hirschsprung’ disease. American Journal of Translational Research. 8 (7), 3159 (2016).
- Takawira, C., D’Agostini, S., Shenouda, S., Persad, R., Sergi, C. Laboratory procedures update on Hirschsprung disease. Journal of Pediatric Gastroenterology & Nutrition. 60 (5), 598 (2015).
- Meier-Ruge, W., et al. Acetylcholinesterase activity in suction biopsies of the rectum in the diagnosis of Hirschsprung’s disease. Journal of Pediatric Surgery. 7 (1), 11-17 (1972).
- Barshack, I., Fridman, E., Goldberg, I., Chowers, Y., Kopolovic, J. The loss of calretinin expression indicates aganglionosis in Hirschsprung’s disease. Journal of Clinical Pathology. 57 (7), 712-716 (2004).
- Kapur, R. P. Can We Stop Looking? Immunohistochemistry and the Diagnosis of Hirschsprung Disease. American Journal of Clinical Pathology. 126 (1), 9-12 (2006).
- Guinardsamuel, V., et al. Calretinin immunohistochemistry: a simple and efficient tool to diagnose Hirschsprung disease. Modern Pathology. 22 (10), 1379-1384 (2009).
- Robey, S. S., Kuhajda, F. P., Yardley, J. H. Immunoperoxidase stains of ganglion cells and abnormal mucosal nerve proliferations in Hirschsprung’s disease. Human Pathology. 19 (4), 432-437 (1988).
- Monforte-Muñoz, H., Gonzalez-Gomez, I., Rowland, J. M., Landing, B. H. Increased submucosal nerve trunk caliber in aganglionosis: a "positive" and objective finding in suction biopsies and segmental resections in Hirschsprung’s disease. Archives of Pathology & Laboratory Medicine. 122 (8), 721-725 (1998).
- Bachmann, L., et al. Immunohistochemical panel for the diagnosis of Hirschsprung's disease using antibodies to MAP2, calretinin, GLUT1 and S100. Histopathology. 66 (6), 824-835 (2015).
- Sams, V. R., Bobrow, L. G., Happerfield, L., Keeling, J. Evaluation of PGP9.5 in the diagnosis of Hirschsprung’s disease. Journal of Pathology. 168 (1), 55 (1992).
- Huang, Y., Anupama, B., Zheng, S., Xiao, X., Chen, L. The expression of enteric nerve markers and nerve innervation in total colonic aganglionosis. International Journal of Surgical Pathology. 19 (3), 303 (2011).
